[發明專利]煙曲霉的實時熒光RPA檢測試劑盒及其專用引物和探針

有效

• 申請號: 201911055768.8
• 申請日: 2019-10-31
• 公開（公告）號: CN110760605B
• 公開（公告）日: 2022-12-09
• 發明（設計）人: 田曙光;韓黎;陳芳艷;蘇雪婷;胡穎嵩;陳勇;趙靜雅
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/68
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 劉娜

1.一種用于RPA檢測的引物組合物，其特征在于，包括：

正向引物，所述正向引物為SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，

反向引物，所述反向引物為SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

2.一種試劑盒，其特征在于，包括：權利要求1所述的引物組合物。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，進一步包括：探針，所述探針為SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述探針的3’端標記有阻抑聚合酶延伸或擴增的基團，所述探針自5’端起第31位堿基標記有熒光基團，所述探針自5’端起第35位堿基標記有淬滅基團，所述探針自5’端起第32位堿基被THF替代。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述阻抑聚合酶延伸或擴增的基團為磷酸基團。

6.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光基團為FAM。

7.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述淬滅基團為BHQ。

8.根據權利要求2～7任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述正向引物與所述反向引物的摩爾濃度比為1:1。

9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述探針與所述正向引物的摩爾濃度比為1:1。

10.權利要求1所述的引物組合物在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于檢測煙曲霉其特征在于，所述檢測包括：

1)以待測樣品DNA為模板，利用權利要求1所述的引物組合物或權利要求2～9任一項所述的試劑盒對所述待測樣品DNA進行RPA檢測；

2)基于檢測結果，確定待測樣品中是否含有煙曲霉。

11.根據權利要求10所述的用途，其特征在于，進一步包括：

步驟1)之前，預先將攜帶煙曲霉anxC4基因的質粒作為標準品，以不同濃度的標準品作為模板，并利用權利要求1所述的引物組合物或權利要求2～9任一項所述的試劑盒對所述標準品進行RPA檢測，

步驟2)是通過如下方式進行的：

基于待測樣品與所述標準品的檢測結果，確定待測樣品中煙曲霉的濃度。

12.根據權利要求11所述的用途，其特征在于，所述攜帶煙曲霉anxC4基因的質粒為pMD19-T-anxC4。

13.根據權利要求12所述的用途，其特征在于，所述pMD19-T-anxC4質粒中，anxC4基因位于pMD19-T質粒的431bp位點和432bp位點之間。

14.根據權利要求12所述的用途，其特征在于，所述pMD19-T-anxC4質粒具有如圖2所示的物理圖譜。

15.根據權利要求10～14中任一項所述的用途，其特征在于，所述待測樣品DNA來源于包括選自分離的菌體，痰、肺泡灌洗液，血液和咽拭子的至少之一。

16.根據權利要求10～14中任一項所述的用途，其特征在于，所述RPA檢測是在溫度為37～42℃的條件下進行15～25分鐘。