[發明專利]利用葉綠體基因組大單拷貝區鑒別楓斗類石斛基源的方法

有效

• 申請號: 201911054085.0
• 申請日: 2019-10-31
• 公開（公告）號: CN110890134B
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 丁小余;李露丹;牛志韜;張本厚;薛慶云;劉薇
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: G16B30/10
• 分類號: G16B30/10;C12Q1/6895
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 黃欣

本發明公開了一種利用葉綠體基因組大單拷貝區(LSC)精準鑒別楓斗類石斛基源的方法。該方法包括以下具體步驟：(1)DNA提取和測序；(2)葉綠體基因組的拼接；(3)葉綠體基因組LSC序列獲取和比對；(4)聚類對比鑒定；(5)結果判定。本發明所提供的方法主要針對基于現有技術難以有效鑒別楓斗類石斛基源的問題，建立了一種利用葉綠體基因組大單拷貝區(LSC)序列進行種質鑒定的方法。該方法適用性廣、操作簡便、易于掌握、準確性高、通用性強，能夠實現對基源復雜的楓斗類石斛高效、精準的鑒定，對確保楓斗類石斛藥材使用的準確性和安全性具有重要意義。

技術領域

本發明屬于藥用植物分子鑒定技術領域，具體涉及一種利用葉綠體基因組大單拷貝區(LSC)對楓斗類石斛基源進行種質鑒定的方法。

背景技術

楓斗類石斛是石斛屬中一組非常重要的類群，其莖柔軟、富含膠質，經過烘焙軟化、去除葉鞘，可加工成緊密或疏松的團狀、彈簧狀藥材，形似“楓斗”，因而稱之為楓斗類石斛。在中國，楓斗類石斛大約有20種，主要分布在秦嶺山脈以南地區。由于其莖富含多糖、石斛堿等藥用成分，楓斗類石斛具有滋陰生津、補脾益胃、潤肺止咳、清音明目等功效。楓斗類石斛基源復雜，其中許多物種在非花期形態上極其相似，很難根據形態學特征區分它們，然而不同楓斗類石斛的藥用成分、功效存在一定差異，市場價格也不盡相同。在目前的藥材市場，以假亂真、以次充好的現象屢見不鮮，這些現象導致了楓斗藥材種質混亂，嚴重影響楓斗類石斛藥材使用的有效性和安全性。因此，楓斗類石斛基源的準確鑒定非常重要。

近年來，隨著分子生物學技術的發展，DNA條形碼技術已經被廣泛地應用于中藥材植物的鑒定，尤其是針對形態上難以區分的類群。在石斛屬中，DNA條形碼候選片段ITS、ITS2、matK、rbcL、psbA-trnH以及線粒體nad?1intron?2等已經被應用去解決復雜的物種鑒定問題。然而這些常用的DNA片段并不能有效地鑒別一些重要的楓斗類石斛，如霍山石斛(Dendrobium?huoshanense)、細莖石斛(D.moniliforme)、鐵皮石斛(D.officinale)、梵凈山石斛(D.fanjingshanense)、美花石斛(D.loddigesii)、杯鞘石斛(D.gratiosissimum)、大包鞘石斛(D.wardianum)等。因此，到目前為止仍然缺乏一種快速，有效地鑒別楓斗類石斛基源的方法。

葉綠體是綠色植物細胞中半自主的細胞器，有獨立的基因組。葉綠體基因組的基因組小、拷貝數高、結構穩定，因此易于測序、組裝和注釋。隨著高通量測序技術的快速發展，葉綠體基因組測序成本急劇下降，越來越多的研究者選擇利用葉綠體全基因組序列鑒別分類上困難的類群。最近，在石斛屬中利用葉綠體基因組進行物種鑒定的研究已有報道。如中國專利文獻CN108763866A，公開了一種利用葉綠體全基因組精準鑒別鐵皮石斛及其近緣極易混淆種的方法，該方法成功地對鐵皮石斛及其近緣極易混淆種進行了高效、精準的鑒別。但該方法使用的是葉綠體全基因組序列，葉綠體基因組的IR/SC節點處結構不穩定，這些節點處序列往往需要進行PCR擴增、Sanger測序驗證并補全，需要花費一些額外的人力和物力。

而本發明使用的葉綠體基因組大單拷貝區(LSC)序列，其結構穩定，更容易拼接并獲得準確的序列，可以省去葉綠體基因組節點處驗證的繁瑣工作。因此，本發明可以大大減少了鑒定的工作量和成本。另外，LSC的大小僅為葉綠體基因組總長度的一半，其較短的長度在一定程度上也可以減少鑒定分析的時間(如序列比對、構樹的時間)。迄今為止，利用葉綠體基因組LSC進行物種鑒定研究還未見報道。

發明內容

本發明針對傳統鑒別方法難以解決楓斗類石斛基源種質鑒定的技術問題，提供了一種利用葉綠體基因組大單拷貝區(LSC)對楓斗類石斛基源進行精準鑒定的方法，該方法操作過程簡單、易于掌握、鑒定結果準確，是一種簡便而可靠的分子鑒定方法。

為了實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案：

一種利用葉綠體基因組大單拷貝區精準鑒別楓斗類石斛基源的方法，包括以下步驟：