[發(fā)明專利]利用葉綠體基因組大單拷貝區(qū)鑒別楓斗類石斛基源的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911054085.0
• 申請(qǐng)日: 2019-10-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110890134B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-05-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁小余;李露丹;牛志韜;張本厚;薛慶云;劉薇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京師范大學(xué)
• 主分類號(hào): G16B30/10
• 分類號(hào): G16B30/10;C12Q1/6895
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 黃欣

1.一種利用葉綠體基因組大單拷貝區(qū)精準(zhǔn)鑒別楓斗類石斛基源的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟1，DNA提取和測(cè)序，提取待測(cè)樣本的總DNA，將得到的DNA樣品進(jìn)行高通量測(cè)序獲取片段序列；

步驟2，葉綠體基因組拼接，將測(cè)序獲得原始序列利用CLC?Genomics?Workbench?6.0.1軟件進(jìn)行修整，參數(shù)設(shè)為：error?probability0.05，將修整后的序列匹配到參考基因組上，測(cè)序深度大于80×的核苷酸位點(diǎn)用于提取consensus序列，從而獲得各樣本的葉綠體基因組序列；

步驟3，葉綠體基因組LSC序列獲取及比對(duì)，從步驟2得到的待檢樣本葉綠體基因組序列中提取LSC序列，與標(biāo)準(zhǔn)參照個(gè)體的LSC序列和外類群物種的LSC序列進(jìn)行多序列比對(duì)；

步驟4，聚類對(duì)比鑒定，對(duì)步驟3比對(duì)后獲得的LSC序列矩陣進(jìn)行手動(dòng)校對(duì)，利用Gblocksv.0.91b軟件，去除空缺和比對(duì)模糊區(qū)域，參數(shù)“allowed?gap?positions”設(shè)為“none”，其余參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，然后利用MEGA?6.0軟件對(duì)LSC序列矩陣構(gòu)建NJ樹(shù)，模型設(shè)為K2P距離模型，bootstrap循環(huán)設(shè)定為1000次；

步驟5，結(jié)果判定，構(gòu)樹(shù)完成后打開(kāi)樹(shù)文件，待檢樣本與其標(biāo)準(zhǔn)參照個(gè)體聚為一支，且支持率大于50％，楓斗類石斛中的各個(gè)物種均得以成功鑒定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1中選擇待測(cè)樣本的葉片或莖尖提取總DNA。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟2中所述參考基因組為霍山石斛葉綠體基因組，GenBank登錄號(hào)LC490207。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟3和步驟5中所述標(biāo)準(zhǔn)參照個(gè)體是在楓斗類石斛的每個(gè)種選擇一株開(kāi)過(guò)花，并經(jīng)專家對(duì)其花部形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，能夠保證其種質(zhì)正確無(wú)誤的個(gè)體。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述楓斗類石斛基源包括霍山石斛、廣東石斛、細(xì)莖石斛、西疇石斛、梵凈山石斛、重唇石斛、鐵皮石斛、曲莖石斛、鉤狀石斛、齒瓣石斛、杯鞘石斛、大包鞘石斛、腫節(jié)石斛、晶帽石斛、玫瑰石斛、束花石斛、羅河石斛、串珠石斛、美花石斛、報(bào)春石斛、兜唇石斛、喇叭唇石斛、梳唇石斛。