[發明專利]一種基于腺病毒的基因編輯方法

在審

• 申請號: 201911053013.4
• 申請日: 2019-10-31
• 公開（公告）號: CN110885799A
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 史其萍;賀小宏;任江濤;王延賓;韓露
• 申請（專利權）人: 南京北恒生物科技有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/113;C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00;A61P31/00;A61P37/02
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 朱欣欣

本發明提供一種重組腺病毒，其包含：目標表達框、位于目標表達框5’端的第一同源臂、位于目標表達框3’端的第二同源臂、一個或兩個sgRNA靶標序列，其中sgRNA靶標序列位于第一同源臂的5’端或第二同源臂的3’端，或分別位于第一同源臂的5’端和第二同源臂的3’端；本發明還提供基于所述重組腺病毒的基因編輯方法、制備基因編輯動物的方法、制備工程化T細胞的方法以及包含所述重組腺病毒的系統、組合物和試劑盒。

技術領域

本發明涉及基因編輯的領域。具體地，本發明涉及一種基于腺病毒的基因編輯方法。

背景技術

嵌合抗原受體T細胞(CART)是目前最有發展前景的腫瘤免疫療法之一，其基本原理主要是提取患者自身的T細胞，并通過基因和細胞工程手段使其表達特異性嵌合抗原受體，使之能夠識別和結合腫瘤細胞表面抗原，從而起到靶向殺傷腫瘤細胞的作用。目前，CAR-T細胞療法已經被美國FDA批準用于治療急性淋巴細胞白血病（ALL）、以及復發性或難治性大B細胞淋巴瘤（LBCL）成人患者的治療，包括彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、原發縱膈大B細胞淋巴瘤（PMBCL）、高級別B細胞淋巴瘤（HGBL），以及轉化濾泡性淋巴瘤（TFL）。

目前，CART制備一般采用慢病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒或非病毒方式的轉座子DNA載體（例如質粒）進行。然而，慢病毒或逆轉錄病毒在進入細胞之后，會隨機地插入到基因組中，這可能會破壞細胞中的其他基因，從而導致細胞異常，甚至可能會讓細胞轉變成腫瘤細胞，進而引發腫瘤。因此，采用這些病毒技術來制備CART進行細胞免疫治療會有引發腫瘤的風險。非病毒方式的轉座子DNA載體可以降低隨機插入的概率，但仍然存在隨機插入的風險，而且利用這種方式將外源DNA轉導入T細胞會造成一定的細胞毒性，同時其臨床效果也尚未令人滿意。采用腺相關病毒制備CART雖然可以定點插入目標基因以解決隨機插入的問題，但其生產純化工藝復雜，不能很好地進行臨床推廣。

因此，需要一種能夠在細胞內進行定點基因編輯的方法和系統，以克服上述技術的缺陷。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于腺病毒的高效的定向基因編輯方法和系統，其能夠解決隨機插入的問題，并且適合工業化規模生產和臨床應用。本發明的目的還在于提供所述基因編輯方法的用途，例如在治療疾病中的用途。

因此，在第一個方面，本發明提供一種重組腺病毒，其包括：目標表達框、位于目標表達框5’端的第一同源臂、位于目標表達框3’端的第二同源臂、一個或兩個sgRNA靶標序列，其中sgRNA靶標序列位于第一同源臂的5’端或第二同源臂的3’端，或分別位于第一同源臂的5’端和第二同源臂的3’端。

在一個實施方案中，目標表達框包含用于對細胞基因組進行改造的序列，例如嵌合抗原受體（CAR）的編碼序列。

在一個實施方案中，第一同源臂和第二同源臂分別與細胞基因組的目標基因序列兩端的300-3000bp的序列互補。在一個優選的實施方案中，第一同源臂和第二同源臂分別與細胞基因組的目標基因序列兩端的400-2500bp，例如400bp、600bp、800bp、1000bp、1200bp、1400bp、1600bp、1800bp、2000bp、2200bp、2400bp或2500bp，或400-2500bp之間的任一長度的序列互補。第一同源臂和第二同源臂的長度可以相同或不同。

在一個實施方案中，本發明的重組腺病毒包括一個sgRNA靶標序列，其位于第一同源臂的5’端或第二同源臂的3’端。在另一個實施方案中，本發明的重組腺病毒包括兩個sgRNA靶標序列，其分別位于第一同源臂的5’端和第二同源臂的3’端，并且所述兩個sgRNA靶標序列可以相同或不同。

在一個實施方案中，本發明的重組腺病毒還包括啟動子、反向末端重復序列（ITR）和/或包裝信號。重組腺病毒的實例包括但不限于Ad5、Ad5F35、Ad35、Ad55、Ad2、Ad5F11、pAdBM5、pADCMV5等。