[發(fā)明專(zhuān)利]一種結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)試劑盒及方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911052201.5
• 申請(qǐng)日: 2019-10-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110607381B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉一博;林強(qiáng);金鑫浩;隋碩;任魯風(fēng);張未來(lái);俞育德;于軍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 寧波胤瑞生物醫(yī)學(xué)儀器有限責(zé)任公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/689
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12R1/32
• 代理公司: 北京精金石知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11470
• 代理人: 張黎

本發(fā)明提供了一種結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)試劑盒及方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)試劑盒包括獨(dú)立包裝的下述試劑：引物探針預(yù)混液、反應(yīng)預(yù)混液、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品；用其檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法包括以下步驟：制備得到數(shù)字PCR混合液、進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)、對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行信號(hào)收集，根據(jù)熒光信號(hào)的類(lèi)型判斷待測(cè)樣品中是否含有結(jié)核分枝桿菌DNA模板及其含量為多少。利用該試劑盒檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌效率高、準(zhǔn)確性好，可以極大的縮短檢測(cè)時(shí)間，無(wú)需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，明顯提高了檢測(cè)特異性和覆蓋度，并且具有較高的穩(wěn)定性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)試劑盒及方法。

背景技術(shù)

結(jié)核分枝桿菌(M.tubercuLosis)簡(jiǎn)稱(chēng)為結(jié)核桿菌(tuberclebacilli，TB)。作為一種古老的疾病，由結(jié)核分枝桿菌感染所致的結(jié)核病困擾人類(lèi)已有數(shù)千年。本菌可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見(jiàn)。人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式，傳染源是接觸排菌的肺結(jié)核患者。結(jié)核病的臨床表現(xiàn)多樣，可累及全身各器官系統(tǒng)，病變往往十分隱匿，給結(jié)核病的診斷及治療帶來(lái)了很大的障礙。因此，結(jié)核病的早期準(zhǔn)確診斷及治療是結(jié)核病疫情控制的關(guān)鍵措施之一。目前結(jié)核病已有的檢查方法包括結(jié)核分枝桿菌涂片抗酸染色、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、組織病理學(xué)檢查、皮膚結(jié)核菌素試驗(yàn)、結(jié)核抗體檢測(cè)和DNA分子檢測(cè)等。但結(jié)核分枝桿菌涂片抗酸染色法的靈敏性和特異性差；結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法檢查時(shí)間長(zhǎng)，易延誤有效診治；組織病理學(xué)檢查創(chuàng)傷大，適用范圍小；而DNA分子檢測(cè)法假陽(yáng)性較高。目前篩查結(jié)核分枝桿菌感染的方法中應(yīng)用最廣泛的是結(jié)核菌素試驗(yàn)，其操作簡(jiǎn)便易行，成本低廉，但卡介苗(BCG)接種及非結(jié)核分枝桿菌感染均可導(dǎo)致其產(chǎn)生假陽(yáng)性，而處于各種免疫抑制狀態(tài)時(shí)可導(dǎo)致其產(chǎn)生假陰性，使其特異性和靈敏性減低。因此，臨床上仍迫切地需要尋找一種用于快速準(zhǔn)確診斷結(jié)核分枝桿菌感染的方法。

結(jié)核分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)主要是細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)，T淋巴細(xì)胞被結(jié)核分枝桿菌抗原致敏后，當(dāng)用相同的抗原再次刺激時(shí)，活化的效應(yīng)T細(xì)胞會(huì)分泌大量細(xì)胞因子或趨化因子，并具有抗原特異性，這些由T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或趨化因子具有良好的結(jié)核分枝桿菌感染診斷潛力。隨著FQ-PCR技術(shù)的發(fā)展，其在結(jié)核病早期診斷領(lǐng)域的應(yīng)用已越來(lái)越廣泛，也越來(lái)越為人所重視，PCR實(shí)際上是一個(gè)在模板DNA、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴(lài)的酶促合成反應(yīng)，擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合。結(jié)核病感染的實(shí)驗(yàn)診斷中，當(dāng)前核酸分子的定量有三種方法，光度法基于核酸分子的吸光度來(lái)定量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RealTimeCR)基于Ct值，Ct值就是指可以檢測(cè)到熒光值對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)；數(shù)字PCR是最新的定量技術(shù)，基于單分子PCR方法來(lái)進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量，是一種絕對(duì)定量的方法。主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門(mén)研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒(méi)有模板的反應(yīng)器就沒(méi)有熒光信號(hào)，根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。

中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)201310009018.3中公開(kāi)了一種結(jié)核分枝桿菌TB檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.01-0.5mM/L，氯化鉀20-300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01-2％和乙醇0.05-1％；所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針。使用本發(fā)明試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，而本發(fā)明中提取核酸時(shí)采用強(qiáng)烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結(jié)構(gòu)，釋放出病原體核酸，無(wú)需加熱即可完成DNA的釋放和提取；本發(fā)明試劑盒檢測(cè)TB的靈敏度可達(dá)400copies/ml(痰液)，定量線(xiàn)性范圍為400-4.00E+09copies/ml；應(yīng)用該試劑盒可以對(duì)痰液等未知樣本中的TB-DNA進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，為診斷TB感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，該申請(qǐng)中公開(kāi)的檢測(cè)為熒光定量PCR檢測(cè)，該檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)靈敏度比較低。