[發明專利]一種基于葉綠體DNA差異的秈粳稻米種類熒光PCR快速檢測鑒定方法

在審

• 申請號: 201911050790.3
• 申請日: 2019-10-31
• 公開（公告）號: CN110669864A
• 公開（公告）日: 2020-01-10
• 發明（設計）人: 陳文炳;邵碧英;繆婷玉;彭娟
• 申請（專利權）人: 福州海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 35100 福州元創專利商標代理有限公司
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

本發明提供一種基于葉綠體DNA序列差異的秈粳稻米種類熒光PCR快速檢測鑒定方法。以正向引物F4：3’?AATCGCAACCCCTTTCCGC?5’，反向引物R1：3’?TTGAGGATTATTCCATGATTCC?5’，建立了秈?粳稻米葉綠體DNA SYBR Green熒光PCR檢測方法，PCR擴增產物秈稻為135 bp、粳稻為204 bp片段，2種稻米的SYBR Green熒光PCR擴增熔解溫度（Tm）為：秈稻Tm值為76.5℃，粳稻Tm值為78.0℃，二者Tm值差為1.5。該熔解溫度（Tm）的差別，用于判別鑒定待測稻米所屬的種類。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于葉綠體DNA序列差異的秈粳稻米種類熒光PCR快速檢測鑒定方法。

背景技術

稻米是多數國家的主糧，也是我國南方地區的主糧，同時也是重要的加工食品的主要原料，主要有2個亞種，即秈稻（米）亞種（Hsien rice, 國際上也稱為Indica rice）與粳稻（米）亞種（Kengrice, 國際上也稱為Japonica rice）^[1]，由于稻米種類不同，其商品價值也不一樣，因此，有必要進行區分鑒別。從稻谷形態上看，2個亞種之間有一定的區別，但經加工成稻米后，要做到精準鑒定，難度較大，稻米粉碎后加工成米制品，完全無法從形態學上加以鑒別。因此，有必要建立稻米種類的DNA鑒定方法。本發明涉及一種基于葉綠體DNA序列差異的秈粳稻米種類熒光PCR快速檢測鑒定方法。該方法的應用，對大米及其加工產品的物種類別的鑒定，維護良好大米及其制品的貿易市場秩序，保護消費者利益，具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于葉綠體DNA序列差異的秈粳稻米種類熒光PCR快速檢測鑒定方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一對檢測鑒定秈粳稻米種類的熒光PCR引物：F4：3’-AATCGCAACCCCTTTCCGC-5’；R1：3’-TTGAGGATTATTCCATGATTCC-5’。

一種基于葉綠體DNA序列差異的秈粳稻米種類熒光PCR快速檢測鑒定方法：以粳稻、秈稻的總DNA為模板，以F4/R1為引物，分別進行SYBR Green熒光PCR擴增；

PCR反應體系：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5μL，引物F4/R1各0.5μL，總DNA 2μL（200ng），ddH₂O補足至25μL；

反應條件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃34s，40個循環；65℃~95℃熔解曲線分析。

上述方法中： SYBR Green熒光PCR擴增產物秈稻為135 bp、粳稻為204 bp片段，SYBR Green熒光PCR擴增熔解溫度（Tm）為秈稻Tm值76.5℃，粳稻Tm值78.0℃，二者Tm值差為1.5；該熔解溫度（Tm）的差別，用于判別鑒定待測稻米所屬的種類。

本發明的優點在于：

本發明提供一種基于葉綠體DNA序列差異的秈粳稻米種類熒光PCR快速檢測鑒定方法。利用秈粳稻米葉綠體DNA序列差異性，即秈稻葉綠體DNA缺失69 bp片段^[2]，設計特異性引物，通過熒光PCR快速檢測鑒定；PCR擴增產物秈稻為135 bp、粳稻為204 bp片段；熒光PCR擴增熔解溫度，秈稻Tm值為76.5℃，粳稻Tm值為78.0℃；通過擴增產物與熔解溫度的雙重差異，準確快速鑒別秈、粳兩種稻米。對大米及其加工產品的物種（實際上是秈粳亞種）類別的鑒定，維護良好大米及其制品的貿易市場秩序，保護消費者利益，具有重要意義。

附圖說明

圖1 SYBR Green熒光PCR結果。A：擴增曲線；B：熔解曲線。