[發(fā)明專利]高通量、自動化的細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911045900.7
• 申請日: 2019-10-30
• 公開（公告）號: CN111139216A
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王振守;李敏;孫瑞強(qiáng);曹云;周航
• 申請（專利權(quán)）人: 上海藥明生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12M1/36;C12M1/00
• 代理公司: 北京林達(dá)劉知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

本發(fā)明公開了一種高通量、自動化的細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)的方法及其應(yīng)用。所述方法包括以下步驟：(1)提供細(xì)胞培養(yǎng)物，進(jìn)行接種和培養(yǎng)；(2)進(jìn)行細(xì)胞沉降，移除反應(yīng)器中的上清液；(3)添加新鮮培養(yǎng)基；(4)根據(jù)上清液中的細(xì)胞密度，計(jì)算放流速率(B)，維持目標(biāo)細(xì)胞密度；(5)重復(fù)上述步驟(2)～(4)，直到細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)完成。本發(fā)明提供的細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)模型與傳統(tǒng)灌流反應(yīng)器相比，其通量大、自動化程度高、培養(yǎng)體積小、花費(fèi)低；與利用搖管進(jìn)行培養(yǎng)相比，其反應(yīng)器特征強(qiáng)、培養(yǎng)結(jié)果代表性高且不易出現(xiàn)人為誤差，可靠性高。另外，本發(fā)明無需使用灌流反應(yīng)器中額外的細(xì)胞截流裝置，從而解決了細(xì)胞截留裝置容易堵塞的問題。

優(yōu)先權(quán)和相關(guān)申請

本申請要求2018年11月1日提交的名稱為高通量、自動化的細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的中國專利申請201811295263.4的優(yōu)先權(quán)，該申請包括附錄在內(nèi)的全部內(nèi)容作為參考并入本申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制藥和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及該領(lǐng)域中的高通量和自動化的細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

經(jīng)過幾十年發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為生產(chǎn)很多重要蛋白(特別是那些糖基化的復(fù)雜大分子蛋白)的成熟技術(shù)。這些蛋白多用于預(yù)防和治療一些嚴(yán)重的人類疾病，例如癌癥、病毒感染、遺傳缺陷疾病和其它慢性疾病。

目前體外細(xì)胞培養(yǎng)模型主要有分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)三種。相對于分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)而言，連續(xù)培養(yǎng)(或稱開放培養(yǎng)、灌流培養(yǎng))因?yàn)槠湓谏a(chǎn)上具有持續(xù)性、培養(yǎng)得到的細(xì)胞密度較高以及終產(chǎn)物一致性較好等方面的獨(dú)特優(yōu)勢而越來越受到重視和推廣。

目前，工業(yè)界中主要使用帶有細(xì)胞截流裝置的反應(yīng)器(稱為灌流反應(yīng)器)進(jìn)行細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞的高效截流和連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)健性。但也有其缺點(diǎn)，主要表現(xiàn)為：1)灌流反應(yīng)器帶有細(xì)胞截流裝置和用于維持連續(xù)化培養(yǎng)的泵/秤/管路以及復(fù)雜的控制組件，其復(fù)雜的操作性極易造成人為失誤，并且需要占用大量人工和時(shí)間進(jìn)行日常操作和監(jiān)視。2)細(xì)胞截流裝置雖然截流效果好，但在長時(shí)間運(yùn)行的情況下，截流膜孔容易堵塞導(dǎo)致反應(yīng)器內(nèi)目標(biāo)蛋白的截留，蛋白收獲率低且質(zhì)量下降。3)灌流反應(yīng)器規(guī)模通常較大(3L至200L不等)，培養(yǎng)時(shí)間長(30天至120天不等)，連續(xù)培養(yǎng)每天需要流加反應(yīng)器培養(yǎng)體積1～2倍的培養(yǎng)基，長期培養(yǎng)對于培養(yǎng)基的消耗巨大，成本也會明顯增加。

由于上述缺陷，灌流反應(yīng)器不適用于高通量的培養(yǎng)基篩選和工藝優(yōu)化。為了節(jié)省成本和提高效率，當(dāng)前工業(yè)界使用最多的是用搖管代替灌流反應(yīng)器進(jìn)行高通量的篩選和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。搖管體積小(20ml)，通量大，通過離心換液能模擬連續(xù)培養(yǎng)操作，因此能一定程度上代替反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)條件的初步篩選和優(yōu)化。但是其缺點(diǎn)依然明顯，主要為：1)不具備反應(yīng)器特征，沒有pH、溶氧、攪拌和通氣控制，因此培養(yǎng)結(jié)果代表性差，不能有效地進(jìn)行反應(yīng)器放大；2)高通量實(shí)驗(yàn)通常需要很大的實(shí)驗(yàn)數(shù)量(20-100不等)，大量的搖管操作需要大量的人工，浪費(fèi)人力成本；3)多數(shù)量且頻繁換液極易引起人工操作誤差，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和代表性。

基于當(dāng)前工業(yè)界中兩種連續(xù)培養(yǎng)模型(即上文所述的灌流反應(yīng)器和搖管)的缺陷，工業(yè)界需要一種高通量且自動化的細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)模型去克服或平衡上述缺陷，因此如何發(fā)展這樣一種指導(dǎo)性的培養(yǎng)模型對于工業(yè)界意義重大。

Ambr15^TM是一種賽多利斯公司生產(chǎn)的高通量自動化微型生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)，其設(shè)計(jì)初衷是用于補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)的高通量篩選和工藝優(yōu)化，本領(lǐng)域技術(shù)人員并不認(rèn)為其具備連續(xù)化培養(yǎng)的功能，并且現(xiàn)有技術(shù)中也沒有記載其具備連續(xù)化培養(yǎng)的功能。本發(fā)明通過技術(shù)創(chuàng)新將細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)模型應(yīng)用于Ambr15^TM系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)的高通量和自動化。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明要解決的問題