[發(fā)明專利]一種同時檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9和2的系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201911044109.4
• 申請日: 2019-10-30
• 公開（公告）號: CN110824164A
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 田蔣為;余伯陽;胡依婷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N33/58;C12Q1/44
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

本發(fā)明公開了一種同時檢測基質(zhì)金屬蛋白酶?9和2的系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用，該系統(tǒng)包括聚多巴胺納米微球?修飾熒光素的核酸適配體納米傳感器和脫氧核糖核酸酶，其中傳感器由MMP?9?aptamer?FAM和MMP?2?aptamer?Texas Red，加入到聚多巴胺納米微球中形成。本發(fā)明制備了猝滅效應(yīng)優(yōu)良的聚多巴胺納米微球，通過非公價鍵結(jié)合構(gòu)建了PDANS?修飾熒光素的核酸適配體納米傳感器，加入DNase?I，水解aptamer，待測物游離，循環(huán)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)熒光信號放大，提高了系統(tǒng)的靈敏度。本發(fā)明制備簡單，反應(yīng)條件溫和，且成本低廉，為基質(zhì)金屬蛋白酶?9和2同時快速檢測提供了一種新的工具和新的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種同時檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9 和2的系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)一大類需要鋅的酶，包括間質(zhì)膠原酶、基質(zhì)蛋白酶、明膠酶等，它們協(xié)同降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分，在各種病理生理過程(包括胚胎發(fā)育、炎癥、傷口愈合和纖維化)以及組織重塑中起著重要作用。其中Ⅳ型膠原酶是其重要的一類，表現(xiàn)形式為基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)，具有降解IV型基底膜膠原的能力。在腎纖維化發(fā)展過程中，腎小管基底膜(TBM)完整性被破壞是導(dǎo)致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) 關(guān)鍵因素，而破壞TBM的兩個最主要的蛋白酶便是MMP-9和MMP-2，這兩個蛋白主要作用于IV型膠原蛋白，但恰好基底膜的最主要成分便是IV型膠原蛋白，在病理情況下，細(xì)胞會不斷分泌產(chǎn)生MMP-9和MMP-2，從而導(dǎo)致TBM的破壞，進(jìn)而促進(jìn)腎纖維化發(fā)展進(jìn)程。如果能夠?qū)崿F(xiàn)對MMP-9和MMP-2的檢測，便一定程度上反映出TBM的完整性，從而可以實(shí)現(xiàn)對TBM的檢測并加以干預(yù)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)藥物預(yù)防和阻斷EMT過程，從而可以有效的緩解整個腎纖維化進(jìn)程。

現(xiàn)有MMP-9或/和MMP-2蛋白含量和活性檢測主要通過提取細(xì)胞蛋白，組織勻漿蛋白，應(yīng)用蛋白免疫印跡、免疫染色、凝膠酶譜等方法測定，但這些方法普遍存在步驟繁冗、耗時較長、檢測成本較高、需要經(jīng)過長期訓(xùn)練的技術(shù)人員操作等不足。目前血清或者尿液中MMP-9或/和MMP-2含量測定主要還是依賴于 ELISA試劑盒，極大地限制了MMP-9和MMP-2在臨床上的檢測。因此亟待發(fā)展一種能夠?qū)崿F(xiàn)更快速、特異、靈敏、簡單的檢測的新工具和新方法。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種同時檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9和2的系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以快速、簡便、靈敏度高和選擇性高的基于脫氧核糖核酸酶-I(DNase-I)同時檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶 -2(MMP-2)。

本發(fā)明還提供了一種同時檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9和2的系統(tǒng)的制備方法和應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，如本發(fā)明所述一種同時檢測基質(zhì)金屬蛋白酶 -9和2的系統(tǒng)，包括聚多巴胺納米微球-修飾熒光素的核酸適配體納米傳感器(PDANS-aptamers)和脫氧核糖核酸酶；所述聚多巴胺納米微球-修飾熒光素的核酸適配體納米傳感器由與修飾FAM熒光素的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)特異性結(jié)合的適配體(MMP-9-aptamer-FAM)和修飾Texas Red熒光素的基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)特異性結(jié)合的適配體(MMP-2-aptamer-Texas Red)，加入到聚多巴胺納米微球(PDANS)中形成。

其中，所述修飾FAM熒光素的基質(zhì)金屬蛋白酶-9特異性結(jié)合的適配體，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示： 5’-FAM-tacggccgcacgaaaaggtgccccataactcaatgccga-3’；所述修飾Texas Red熒光素的基質(zhì)金屬蛋白酶-2特異性結(jié)合的適配體，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示： 5’-Texas Red-tcgccgtgtaggattaggccaggtatgggaacccggtaac-3’。