[發明專利]一種同時檢測基質金屬蛋白酶-9和2的系統及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201911044109.4
• 申請日: 2019-10-30
• 公開（公告）號: CN110824164A
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發明（設計）人: 田蔣為;余伯陽;胡依婷
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N33/58;C12Q1/44
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

1.一種同時檢測基質金屬蛋白酶-9和2的系統，其特征在于，包括聚多巴胺納米微球-修飾熒光素的核酸適配體納米傳感器和脫氧核糖核酸酶；所述聚多巴胺納米微球-修飾熒光素的核酸適配體納米傳感器由修飾FAM熒光素的基質金屬蛋白酶-9特異性結合的適配體和修飾Texas Red熒光素的基質金屬蛋白酶-2特異性結合的適配體，加入到聚多巴胺納米微球中形成。

2.根據權利要求1所述的同時檢測基質金屬蛋白酶-9和2的系統，其特征在于，所述修飾FAM熒光素的基質金屬蛋白酶-9特異性結合的適配體，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-FAM-tacggccgcacgaaaaggtgccccataactcaatgccga-3’；所述修飾Texas Red熒光素的基質金屬蛋白酶-2特異性結合的適配體，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’-TexasRed-tcgccgtgtaggattaggccaggtatgggaacccggtaac-3’。

3.根據權利要求1所述的同時檢測基質金屬蛋白酶-9和2的系統，其特征在于，所述聚多巴胺納米微球優選由鹽酸多巴胺、Tris-HCl緩沖液、異丙醇和氨水合成。

4.一種權利要求1所述的同時檢測基質金屬蛋白酶-9和2的系統的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將Tris-HCl緩沖液和異丙醇中加入氨水；攪拌使得溶液充分混勻；

(2)取鹽酸多巴胺溶于超純水中，加入到上述(1)攪拌混勻的溶液中，避光繼續攪拌；

(3)將步驟(2)得到溶液離心棄去上清液，超純水溶解沉淀，混勻，離心，棄去上清液，反復直至上清液澄清；

(4)離心純化后，沉淀即為聚多巴胺納米微球(PDANS)，冷凍干燥成粉末備用；

(5)修飾FAM熒光素的基質金屬蛋白酶-9(MMP-9-aptamer-FAM)特異性結合的適配體(aptamer)和修飾Texas Red熒光素的基質金屬蛋白酶-2(MMP-2-aptamer-Texas Red)特異性結合的適配體(aptamer)，加入到聚多巴胺納米微球溶液中，混勻，形成聚多巴胺納米微球-修飾熒光素的核酸適配體(PDANS-aptamers)納米傳感器；

(6)將基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)以及脫氧核糖核酸酶(DNase-I)加入到PDANS-aptamers納米傳感器中反應，MMP-9和MMP-2分別和aptamer特異性結合，aptamer從PDANS表面解離下來，DNase-I選擇性水解aptamers，釋放MMP-9和MMP-2，進行下一輪循環反應；

(7)酶標儀讀取熒光值，分別建立MMP-9和MMP-2濃度與熒光值的線性標曲得到同時檢測基質金屬蛋白酶-9和2的系統。

5.根據權利要求4所述的同時檢測基質金屬蛋白酶-9和2的系統的制備方法，其特征在于，步驟(5)中所述聚多巴胺納米微球(PDANS)溶液濃度為0.3-0.6mg/mL，MMP-9-aptamer-FAM和MMP-2-aptamer-Texas Red濃度分別為100-200nM。

6.根據權利要求4所述的同時檢測基質金屬蛋白酶-9和2的系統的制備方法，其特征在于，步驟(6)中所述脫氧核糖核酸酶(DNase-I)為5-20U，反應溫度為37℃，反應時間為1-2h，反應緩沖液5-10mM CaCl₂、2-5mM MgCl₂。

7.根據權利要求4所述的同時檢測基質金屬蛋白酶-9和2的系統的制備方法，其特征在于，步驟(7)中所述MMP-9和MMP-2與熒光值的線性關系分別為：當MMP-9濃度在24～600pg/mL范圍內符合線性方程Y＝0.0006X+0.3704，R²＝0.9904；當MMP-2濃度在64～1600pg/mL范圍內符合線性方程Y＝0.0001X+0.5358，R²＝0.982，其中，Y為酶標儀讀數，X為MMP-9或MMP-2濃度。

8.一種權利要求1所述同時檢測基質金屬蛋白酶-9和2的系統在制備檢測同時檢測基質金屬蛋白酶-9和2試劑或者工具中的應用。