[發明專利]鑒別冬蟲夏草的PCR試劑盒及PCR方法

在審

• 申請號: 201911043013.6
• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN112725473A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 段慶梓;梁恒興;王巍;戴琪;張彪;尚柯;張玉
• 申請（專利權）人: 成都市食品藥品檢驗研究院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發明提供了一種新的冬蟲夏草真偽鑒別的試劑盒和檢測方法，屬于PCR檢測領域。本發明的關鍵在于序列如SEQ ID NO.1?2所示的引物，能夠廣泛鑒別不同的冬蟲夏草偽品，特異性高；本發明的試劑盒因此能夠實現冬蟲夏草真偽的準確鑒別。另外，本發明的試劑盒和檢測方法十分穩定，可以適用于不同的取樣位置、PCR儀、Taq酶。本發明的試劑盒和方法可以快速簡便冬蟲夏草真偽，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于PCR檢測領域，尤其涉及一種鑒別冬蟲夏草的PCR試劑盒及方法。

背景技術

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體復合體。作為傳統的名貴中藥材，冬蟲夏草的藥用歷史久遠。近些年，冬蟲夏草在保健品市場也越來越受到人們的青睞。由于冬蟲夏草人工培育技術尚未突破，其來源僅依靠野生采挖，近年來的過度采挖，導致野生資源的急劇減少，已難以滿足日益增長的市場需求，導致其價格居高不下(約300-400元/克)，因此市場流通的冬蟲夏草摻雜造假現象屢見不鮮，不僅損害消費者利益，甚至對用藥安全帶來潛在風險。

現行《中國藥典》(2015年版)關于“冬蟲夏草”的標準規定只有“性狀”和“腺苷含量測定”兩項，其中性狀鑒別較為依賴檢驗員的經驗積累，缺乏客觀性，而腺苷含量的測定又缺乏一定的專屬性。

國家標準，冬蟲夏草真偽鑒別實時熒光PCR法(標準編號：SN/T 3957-2014)規定，使用以序列為5’-CAAGGTCTCCGTTGGTGA-3’(SEQ ID NO.1)和5’-AACTGCTGTGGTGTTCGC-3’(SEQ ID NO.2)的引物，序列為5’-(FAM)-CGGAGGGATCATTATCGAGTYACCACT-(TAMRA)-3’(SEQID NO.3)的探針對冬蟲夏草的DNA進行熒光定量PCR，如同時進行的陰性、陽性、空白對照實驗結果正常，檢測樣品無熒光增幅現象，判斷樣品不是冬蟲夏草；如同時進行的陰性、陽性、空白對照實驗結果正常，檢測樣品有明顯的熒光增幅曲線，且Ct值≤35，判斷樣品為冬蟲夏草或含有冬蟲夏草成分；如同時進行的陰性、陽性、空白對照實驗結果正常，檢測樣品熒光增幅曲線的Ct值在35-40之間，則應重新進行實時熒光PCR反應。再次擴增后的結果Ct值仍在35-40之間，可判斷樣品為冬蟲夏草或含有冬蟲夏草成分，否則可判斷樣品為非冬蟲夏草或不含有冬蟲夏草成分。而在實際檢測中，部分偽品蟲草的Ct值經重復試驗后仍在35-40之間，依據該標準中FAM熒光Ct值的判定原則，偽品蟲草也判斷為冬蟲夏草或含有冬蟲夏草成分，這一結果與實際樣品不符。表明該方法不適宜用于中藥材冬蟲夏草及其偽品的真偽鑒別。

文獻1【Li X，Song JY，Xin TY，et al.DNA barcoding the commercial Chinesecaterpillar fugus[J].FEMS Microbiol Lett，2013，347：156-162】公開到：利用冬蟲夏草與其他偽品蟲草之間存在的“barcode gaps”，通過設計的通用引物進行PCR反應后測序，并進行序列間的BLAST和構建進化樹來區分冬蟲夏草及其偽品。但該方法提出的通用引物可能會對冬蟲夏草表面附著的其他真菌進行擴增，這樣就容易造成測序結果的不準確性，從而影響序列的比對分析結果，并且，該方法需要后續的測序、序列比對等步驟，實驗過程較為繁瑣。

文獻2【張文娟，康帥。基于ITS序列分析鑒別冬蟲夏草與古尼蟲草[J].藥物分析雜志，2015，35(9)：1551-1555.】利用PCR-RFLP方法對冬蟲夏草與古尼蟲草進行鑒別，但由于四川產區的部分冬蟲夏草在ITS區酶切位點的堿基突變，使得該方法無法準確鑒別。因此，該方法的適應性較差。

文獻3【段慶梓，尚柯等。冬蟲夏草的分子鑒定方法[J].華西藥學雜志，2017，32(2)：205-207.】建立了一種PCR鑒定冬蟲夏草的方法，但其所涉及蟲草偽品的種類數量較少，不能完全覆蓋常見的偽品蟲草。

目前缺乏一種特異性高、重復性好、結果準確的冬蟲夏草鑒定方法。