[發(fā)明專利]基于游離DNA甲基化或羥甲基化差異的主動(dòng)脈夾層檢測(cè)方法及系統(tǒng)

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911040573.6
• 申請(qǐng)日: 2019-10-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110684836A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉贇;劉佩茹;邱文青;杜多;張丹丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 31200 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 陸飛;陸尤

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體為基于游離DNA甲基化或羥甲基化差異的主動(dòng)脈夾層檢測(cè)方法及系統(tǒng)。本發(fā)明方法包括：（一）游離DNA甲基化或羥甲基化差異檢測(cè)，包括：整體甲基化或羥甲基化水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；特定位點(diǎn)或區(qū)域甲基化或羥甲基化水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在基因組中的分布規(guī)律差異；（二）根據(jù)DNA甲基化或羥甲基化差異判別主動(dòng)脈夾層是否發(fā)生。本發(fā)明系統(tǒng)包括游離DNA甲基化或羥甲基化差異檢測(cè)模塊和主動(dòng)脈夾層發(fā)生判別模塊。本發(fā)明取材方便，處理簡(jiǎn)單，避免繁復(fù)的手術(shù)取材；以DNA甲基化或DNA羥甲基化作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，這種化學(xué)修飾具有穩(wěn)定的組織特異性，能明確反映組織來(lái)源和狀態(tài)，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及主動(dòng)脈夾層的檢測(cè)方法及系統(tǒng)。

背景技術(shù)

主動(dòng)脈夾層是指主動(dòng)脈腔內(nèi)血液從內(nèi)膜撕裂處進(jìn)入中膜，形成主動(dòng)脈壁的真假兩腔，該病常伴有一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥且致死率高。臨床上主動(dòng)脈夾層可分為A型和B型，其中A型包括升主動(dòng)脈，一般情況下需要手術(shù)切除，否則短時(shí)間內(nèi)病患將受到生命威脅。雖然目前已有一些研究表明基因突變和家族遺傳性?shī)A層有關(guān)[1-3]，但依然不能解釋夾層的產(chǎn)生機(jī)制，而最近的研究表明，生活方式等環(huán)境因素也能導(dǎo)致夾層的發(fā)生[4-6]，然而具體的機(jī)制也并不清晰。另外，胸痛是主動(dòng)脈夾層主要的臨床表現(xiàn)之一，但對(duì)于其他有同樣癥狀的疾病，比如肺栓塞，急性心肌梗塞等，臨床上很難快速做出判斷[7]，尤其是在醫(yī)療條件落后的地區(qū)。目前，除了一些醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)比如斷層掃描和核磁共振等技術(shù)，沒(méi)有有效的生物標(biāo)記物可用于主動(dòng)脈夾層的檢測(cè)，尤其是A型主動(dòng)脈夾層。

人體游離DNA是指人體內(nèi)不同組織中細(xì)胞死亡后所釋放到血液中裸露的DNA片段，由于其易獲取性以及具備組織特異性的特點(diǎn)[8]，游離DNA被廣泛應(yīng)用于液體活檢[9-11]。而DNA表觀修飾比如DNA甲基化和羥甲基化則是追蹤游離DNA其組織來(lái)源的重要依據(jù)之一，有大量研究探索了不同生理狀態(tài)下，比如癌癥，游離DNA中甲基化和羥甲基化的改變[12-14]。另外，有研究以特定DNA片段的甲基化作為標(biāo)記物，從游離DNA中檢測(cè)到心肌組織特異的DNA片段，反映心肌細(xì)胞的死亡[15]，表明游離DNA應(yīng)用于心血管疾病檢測(cè)的潛力。

表觀遺傳是指在不改變DNA序列的情況下調(diào)控基因的表達(dá)，并能將這種變化遺傳給后代。近來(lái)大量研究表明表觀調(diào)控，比如DNA甲基化以及羥甲基化和腫瘤的發(fā)生以及一些代謝和免疫疾病有著密切的關(guān)聯(lián)[16, 17]。另外，在一些心血管疾病，比如心臟衰竭，心血管發(fā)育異常以及主動(dòng)脈瓣鈣化中，DNA甲基化在對(duì)關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控中扮演非常重要的角色[18-20]。

目前，針對(duì)DNA甲基化或DNA羥甲基化研究的技術(shù)方法有很多。比如被視為DNA甲基化檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)的全基因組甲基化測(cè)序（Whole genome bisulfite sequencing, WGBS）以及焦磷酸測(cè)序（Pyro-sequencing），利用甲基化/羥甲基化特異抗體捕獲甲基化/羥甲基化區(qū)段的DNA甲基化/羥甲基化免疫共沉淀技術(shù)(MeDIP，hMeDIP)。但在已發(fā)表的工作中，鮮有將成熟的DNA甲基化或DNA羥甲基化檢測(cè)技術(shù)成功應(yīng)用于游離DNA對(duì)主動(dòng)脈夾層的檢測(cè)中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種取材方便、處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠的主動(dòng)脈夾層檢測(cè)方法及檢測(cè)系統(tǒng)。

本發(fā)明提供的主動(dòng)脈夾層檢測(cè)方法，是基于游離DNA甲基化或DNA羥甲基化差異的，即利用游離DNA甲基化或DNA羥甲基化差異作為檢測(cè)分子標(biāo)記，在檢測(cè)之前先做如下準(zhǔn)備：提取人體游離DNA：包括用抗凝管收集人外周血2-5ml，離心兩次取上層血清；使用商業(yè)化試劑盒進(jìn)行游離DNA提取，等等。

檢測(cè)的具體步驟為：

（一）游離DNA甲基化或羥甲基化差異檢測(cè)

收集由DNA甲基化或DNA羥甲基化檢測(cè)技術(shù)得到主動(dòng)脈夾層患者、正常人和其他病人游離DNA的甲基化或羥甲基化數(shù)據(jù)；