[發明專利]用于檢測多種菌的多重熒光定量PCR引物、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201911039964.6
• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN110904250B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 夏廣亮
• 申請（專利權）人: 知幾未來（成都）臨床醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01;C12R1/225;C12R1/23;C12R1/25
• 代理公司: 北京華清迪源知識產權代理有限公司 11577
• 代理人: 杜立軍

本發明實施例公開了用于檢測多種菌的多重熒光定量PCR引物、試劑盒及檢測方法，其包括針對長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和阿克曼氏菌菌的16SrDNA設計引物對及探針，其中，所述長雙歧桿菌、動物雙歧桿菌和短雙歧桿菌的引物對的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示。本發明還公開一種包含上述PCR引物和探針的多重熒光定量PCR檢測試劑盒。本發明實施例提供的用于檢測多種菌的多重熒光定量PCR引物和探針，其是按照經過多次實驗和設計出的特定序列合成引物和探針，經過實驗優化的特定引物和探針可以保證擴增的時候能保證較好的特異性和減少同一個反應體系內的引物探針的相互之間的干擾。

技術領域

本發明實施例涉及微生物檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測多種菌的多重熒光定量PCR引物、試劑盒及檢測方法。

背景技術

人體腸道微生物與人的健康有著密切的關系，有些重要種類的細菌所占比例對于人體的健康有重要的影響。通過檢測腸道微生物中一些重要的菌種的含量和所占比例，對于判斷受檢者的某些健康狀況和輔助治療有著一定的意義。目前針對細菌數量和種類的常見的檢測方法有：1、傳統的選擇性培養基培養：該方法主要是通過特定的培養基對樣本中特定細菌進行培養，通過菌落的數量來反應樣本中該種細菌的數量。該方法是經典、常用的方法，檢測結果較為準確。該方法的缺點是：培養的周期長，一般需要數天；檢測通量低，有很多對培養條件要求嚴格的細菌很難培養，鑒定的精度一般，多數情況下無法準確的區分亞種或者突變株。無法發現未知的菌種，多數情況無法在同一個培養基中同時檢測多種菌。2、生化鑒定：利用待檢菌種產生的特異化學物質，通過特異性的化學反應來檢測樣本中的對應菌種有無。檢測時間相對培養基培養的方法短一些，通量有所提高。但是同樣存在檢測的精度有限，無法區分亞種或者突變株。另外有很多菌無法產生特異的化學物質，無法采用本方法檢測；多數情況無法通過同一個反應檢測多種菌。3、熒光定量PCR：根據相應菌種的特異DNA序列設計探針和引物，通過對該菌的DNA進行檢測來確認該菌種的有無或者含量。本檢測方法檢測時間短，檢測靈敏度高，DNA提取和擴增只需幾小時；檢測精度高，可以精確到亞種或者突變株；而且可以通過一個反應檢測多種菌。缺點是需要知道待檢測菌的特異DNA序列，無法檢測未知序列的菌或突變的菌株，如果菌的DNA在引物或者探針處發生了SNP突變會影響檢測和定量的準確性。4、NGS二代測序：利用宏基因組或者16S方式對樣本提取的DNA進行建庫，通過二代測序和生物信息學分析獲得各種菌的種類和比例。優點是檢測通量高，檢測靈敏度高，檢測結果準確，宏基因組的方式能夠檢測到一些未知的菌。缺點是檢測周期相對較長，檢測成本較高。

目前有不少領域需要對樣本中的少數幾種特定的已知菌進行檢測。需要在短時間內檢測出樣本中是否含有這些菌，以及這些菌在樣本中的各自含量。這些檢測多數都對檢測周期和檢測精度要求比較高，從樣本開始檢測到得出檢測結果的時間一般要求一天之內甚至更短，菌也需要精確到種或者亞種水平。因此，熒光定量PCR成為一種常見的檢測手段，能在數小時之內得到檢測結果，并且可以精確地得到樣本中的菌在種，亞種水平的數量。

當前用的較廣的熒光定量法檢測一般是一管反應體系里面檢測一種菌。不僅檢測通量相對較低，而且檢測成本也比較高。如果使用多重PCR擴增和檢測技術，可以在一管反應里檢測多種菌，能夠極大的提高檢測通量和降低了檢測成本。