[發明專利]一種快速鑒定果園高效解磷細菌的特異性引物及其試劑盒、分離鑒定方法

在審

• 申請號: 201911037566.0
• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN110592249A
• 公開（公告）日: 2019-12-20
• 發明（設計）人: 徐麗;劉慶忠;宗曉娟;魏海蓉;陳新;張力思;譚鉞;王甲威;朱東姿;洪坡
• 申請（專利權）人: 山東省果樹研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 37218 濟南泉城專利商標事務所
• 代理人: 陳娟

本發明屬于分子生物技術領域，具體涉及一種快速鑒定果園高效解磷細菌的特異性引物及其試劑盒、分離鑒定方法。本發明所提供的特異性引物為pqqB1?F和pqqB1?R引物對：所述pqqB1?F的序列如SEQ ID NO:1所示；所述pqqB1?R的序列如SEQ ID NO:2所示。本發明采用改良后的PVK培養基，同時，使用百里溴酚藍作為指試劑，陽性解磷菌菌株易于觀察和計數，快速且易于操作和觀察。本發明設計的引物pqqE1?F和pqqE1?R能夠快速檢測溶磷細菌，具有特異性好，能夠準確的檢測溶磷細菌，解決了常規方法耗時且成本高，基因特異性研究針對目標功能組進行研究，可以解決細菌中眾多的未知機制。

技術領域

本發明屬于分子生物技術領域，具體涉及一種快速鑒定果園高效解磷細菌的特異性引物及其試劑盒、分離鑒定方法。

背景技術

磷(P)是一種不可再生的大量營養元素，參與植物許多代謝過程，包括細胞分裂、糖類物質代謝、脂類代謝、光合作用以及呼吸作用等過程，磷元素對維持植物的生長發育是必不可缺的。植物從土壤中吸收磷是植物獲取磷元素的主要途徑之一，但土壤中約有95%以上的磷是不易被植物體直接吸收利用的。目前，施用磷肥成為了提高土壤有效磷含量的主要手段。然而，大多數磷肥施于土壤后可用磷會快速被Ca²⁺（主要為堿性土壤），Al³⁺和Fe³⁺（酸性土壤）結合形成難溶性沉淀，并且不能被植物吸收利用，導致P的使用效率低和潛在的P過量。長期施用磷肥不但增加了經濟成本，又易引發和造成環境污染。因此，必須設法減少土壤P的損失，提高其利用效率。

微生物能積極參與許多生物地球化學過程。其中細菌是最活躍的土壤成分，具有快速的繁殖能力，且溶解磷的能力是最有效的。解磷細菌是一類可以將難溶性磷轉化為能被植物吸收的有效磷的微生物，可以改善植物生長的磷素營養。其還可以防止被釋放的P再次被固定。它們能夠通過螯合，交換反應和分泌有機酸將不溶性無機磷酸鹽轉化為可溶性形式。解磷菌通過分泌有機酸，特別是葡萄糖酸(GA)、2-酮葡萄糖酸、檸檬酸、酒石酸、草酸和其他羧酸，對土壤中不溶性磷酸鹽具有增溶能力。這些酸的羥基和羧基螯合與磷酸鹽結合的陽離子，或通過釋放H⁺質子使陽離子溶解，將其轉化為可溶性磷酸鹽。存在于土壤中的根際細菌、內部共生細菌被認為是最有效的解磷微生物，但是其在植物根際的數量不足以與其他微生物競爭，難以發揮其活性，因此篩選高效的解磷菌作為土壤接種物是一種有效改善植物生長和產量的方法。許多用于篩選解磷菌的方法已經被報道了，但是僅僅在培養皿上分離解磷菌是耗時且費力的。開發一種能夠快速分離篩選及鑒定解磷菌的方法成為了亟待解決的問題。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種快速鑒定果園高效解磷細菌的特異性引物。

本發明還提供了一種包含上述引物的快速鑒定果園高效解磷細菌的試劑盒。

本發明還提供了一種利用上述引物或試劑盒對果園高效解磷細菌的分離鑒定方法。

本發明為了實現上述目的所采用的技術方案為：

本發明提供了一種快速鑒定果園高效解磷細菌的特異性引物，所述引物為pqqB1-F和pqqB1-R引物對：所述pqqB1-F的序列如 SEQ ID NO:1所示；所述pqqB1-R的序列如SEQ IDNO:2所示。

本發明還提供了一種含有上述特異性引物的試劑盒， 12.5 μl，ddH2O 9.5μl。

本發明還提供了一種利用上述特異性引物進行果園高效解磷細菌的分離鑒定方法，包括以下步驟：

（1）選取地表下5-15cm土壤作為土壤樣品，多點采集混勻，置于密封袋中，并在4℃保存備用；