[發明專利]一種快速鑒定果園高效解磷細菌的特異性引物及其試劑盒、分離鑒定方法

在審

• 申請號: 201911037566.0
• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN110592249A
• 公開（公告）日: 2019-12-20
• 發明（設計）人: 徐麗;劉慶忠;宗曉娟;魏海蓉;陳新;張力思;譚鉞;王甲威;朱東姿;洪坡
• 申請（專利權）人: 山東省果樹研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 37218 濟南泉城專利商標事務所
• 代理人: 陳娟

1.一種快速鑒定果園高效解磷細菌的特異性引物，其特征在于，所述引物為pqqB1-F和pqqB1-R引物對：所述pqqB1-F的序列如 SEQ ID NO:1所示；所述pqqB1-R的序列如SEQ IDNO:2所示。

2.一種含有權利要求1所述的特異性引物的試劑盒，其特征在于，包括序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的引物對各1 μl、2×Pfu PCR Mix 12.5 μl，ddH2O 9.5μl。

3.一種利用權利要求1所述的特異性引物進行果園高效解磷細菌的分離鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）選取地表下5-15cm土壤作為土壤樣品，多點采集混勻，置于密封袋中，并在4℃保存備用；

（2）選用改良的PVK培養基，同時加入10μM百里溴酚藍作為指示劑，使用96孔板快速篩選解磷菌菌株，每個孔中加入150μL培養基，然后稱取5g土壤樣品，用研缽研碎置于含45mL無菌水的三角瓶中， 振蕩混勻，靜止5min，然后取1μL溶液加入9μL無菌水的離心管內，然后將懸浮液連續稀釋為10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5和10^-6，向96孔板每個孔中加入1μL稀釋的土壤懸浮液，每個濃度重復3次，然后在28℃下孵育至少72h；未接種的孔作為對照；沒有細菌生長的孔被認為是陰性的，具有細菌生長但沒有明顯顏色變化的孔被認為含有不確定菌株，具有明顯細菌生長和黃色的孔被認為是陽性的；

（3）利用聚合酶鏈反應擴增16S rDNA基因區域，利用引物對對分離的細菌進行分子鑒定：提取細菌基因組DNA，使用Pfu DNA聚合酶進行PCR擴增，擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測；

（4）利用引物pqqB1-F和pqqB1-R，使用2×Pfu PCR預混試劑進行PCR擴增，擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測。

4. 根據權利要求3所述的分離鑒定方法，其特征在于，步驟（2）中，所述改良的PVK培養基的配方為：葡萄糖10.0g，Ca₃(PO₄) 5.0g，NaCl 0.3g，MgSO₄ 0.3g，KCl 0.3g，酵母浸膏0.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，MnSO₄ 0.03g，FeSO₄ 0.03g，蒸餾水1 000mL，pH值7.0～7.5。

5.根據權利要求3或4所述的分離鑒定方法，其特征在于，步驟（2）中，所述振蕩混勻的條件為：在28℃溫度下，160r/min振蕩混勻30 min。

6.根據權利要求3所述的分離鑒定方法，其特征在于，步驟（3）中，所述分子鑒定的引物對序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

7. 根據權利要求6所述的分離鑒定方法，其特征在于，步驟（3）中，所述PCR擴增的50μl擴增體系為：DNA模板2μl，27F（10 μM）1 μl，1492R（10 μM）1 μl，10xPfu 5 μl，dNTPMixture（2.5 mM）4 μl，Pfu DNA Polymerase（2.5U/μl）0.5 μl，ddH2O 35.5μl；擴增條件為：94℃擴增5 min，然后94℃ 1 min，52℃ 40 sec，72℃ 1 min，35個循環，最后72℃10min。

8.根據權利要求3所述的分離鑒定方法，其特征在于，步驟（4）中，所述PCR擴增的25μl擴增體系為：DNA模板2μl，引物pqqB1-F （10 μM）1 μl，引物pqqB1-R （10 μM）1 μl，2×PfuPCR Mix 12.5 μl，ddH2O 9.5μl；擴增條件為：94℃擴增5 min，然后94℃ 1 min，58℃ 30sec，72℃ 30 sec，35個循環，最后72℃ 10min。