[發(fā)明專利]一種用于鑒定方格星蟲遺傳性別的探針及方法

有效

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• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN110734968B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發(fā)明（設計）人: 李文華;吳雅琴;陳琪薇
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12Q1/6879
• 分類號: C12Q1/6879;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 陳雪瑩

本發(fā)明公開一種用于鑒定方格星蟲遺傳性別的探針及方法，本發(fā)明通過高通量測序手段，經(jīng)生物信息學分析鑒定出一條雌性特異的基因片段，序列為SEQ ID NO：1，根據(jù)該基因片段設計鑒定方格星蟲遺傳性別的特異性引物F1和R1，該引物只在雌性個體中有擴增產(chǎn)物。本發(fā)明不受方格星蟲的發(fā)育時期、個體大小等因素的限制，提取一定量的體腔液就可快速、準確、有效地區(qū)分方格星蟲遺傳性別；以及無需殺死蟲體，遺傳性別鑒定后的蟲體仍可用于生產(chǎn)繁殖實踐需要。本發(fā)明能夠有效地促進方格星蟲人工繁殖技術的提高，對于方格星蟲養(yǎng)殖實踐有著重要的理論意義和應用價值。

技術領域

本發(fā)明涉及水產(chǎn)生物技術和水產(chǎn)養(yǎng)殖領域中的海洋星蟲遺傳性別鑒定和性別控制技術，具體涉及一種鑒定方格星蟲遺傳性別的方法及探針。

背景技術

方格星蟲(Sipunculus nudus)俗稱“沙蟲”，廣泛分布于我國東南沿海，是一種名貴的海產(chǎn)珍品。該種生物味道鮮美、營養(yǎng)豐富，具有重要的食用和藥用價值。生產(chǎn)上所用的方格星蟲主要來自于天然捕撈，但是，因過度開采及環(huán)境污染，星蟲資源急劇下降，因此亟需進一步探索方格星蟲的繁殖機制來改善人工繁育技術，以滿足生產(chǎn)需要。

方格星蟲為體外受精，雌雄異體，性成熟最短時間為11個月，其生殖腺分布于翻吻肌基部，腺體細小，肉眼難以識別，僅在排卵期明顯。全年都可以在其體腔中觀察到生殖細胞，生殖細胞的發(fā)育隨季節(jié)的變化而變化。星蟲動物的配子發(fā)生過程比較特別，原生殖細胞在發(fā)育早期便以單細胞或細胞團的形式從性腺脫落進入到體腔液中繼續(xù)發(fā)育至成熟，發(fā)育成熟后進入腎管。發(fā)育成熟的方格星蟲，雄性個體腎管內為乳白色的精子，雌性個體腎管內為暗紅色的卵子。雌雄個體外形相似，沒有明顯的第二性征，無法直接從外形上判斷雌雄。在養(yǎng)殖實踐中，可以透過半透明的體壁觀察腎管顏色來區(qū)分雌雄個體。

在生殖細胞發(fā)育成熟之前，方格星蟲的雌蟲和雄蟲難以從外觀上進行區(qū)分，且不存在異形性染色體。在生殖細胞發(fā)生之后，雖然可以通過抽取體腔液的方式，從細胞學的角度進行區(qū)分，但對于經(jīng)驗不豐富者來說，在實際鑒定中會出現(xiàn)假陰性，從而對雄性和雌性個體的鑒定造成誤判，這給方格星蟲人工育種技術的開發(fā)帶來了極大困難。因此，開發(fā)方格星蟲雌性特異分子探針，有助于揭示其生殖相關的分子機理，在分子水平上掌握其生殖的基本規(guī)律及其調控機制，以期有效地促進人工繁殖技術的提高，對于方格星蟲養(yǎng)殖實踐有著重要的理論意義和應用價值。

此外，目前尚未見關于方格星蟲雌性特異分子探針及其應用相關的報道。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定方格星蟲遺傳性別的探針及方法，本發(fā)明不受方格星蟲的發(fā)育時期、個體大小等因素的限制，提取一定量的體腔液就可實現(xiàn)性別的準確鑒定，為方格星蟲的性別控制、人工育種提供一種技術手段。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

一種用于鑒定方格星蟲遺傳性別的探針，包括引物F1：GCAGATTCTTCGGGTACTGTTC，引物R1：AGGAGAGATGGTTGTGGGACT。

一種鑒定方格星蟲遺傳性別的方法，包括以下步驟：

(1)抽取方格星蟲體腔液，用于mRNA的提取；

(2)在體腔液中按1：5比例加入Trizol溶液(Takara公司)，在4℃下離心；

(3)加入的氯仿，混勻，室溫下靜置；然后于4℃下離心；

(4)取上清，加入異丙醇，混勻，離心；

(5)棄上清，加入75％乙醇，混勻，離心；

(6)棄上清，在酒精燈附近將離心管晾干，晾干后加入50μl水，溶解所獲得的mRNA，使用Nanodrop1000定量，并進行瓊脂糖凝膠電泳確定mRNA質量；

(7)使用cDNA合成試劑盒進行逆轉錄；