[發明專利]一種提高木糖酸脫水酶活性的基因工程菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201911036211.X
• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN110591997B
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 王昕;陳可泉;麥丹丹
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/60;C12N15/31;C12P7/18;C12R1/19
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 葉帥東

本發明公開了一種提高木糖酸脫水酶活性的基因工程菌及其構建方法與應用，構建克隆表達鐵硫簇插入蛋白SufA，并將構建好的基因轉入宿主菌細胞內得基因工程菌，所述基因工程菌用于發酵生產D?1,2,4?丁三醇的中間產物2?酮基?3?脫氧?d?木糖酸。通過提高了木糖酸脫水酶的活性，進而促進了木糖酸的消耗并提高了2?酮基?3?脫氧?d?木糖酸的產量，最后提高了D?1，2，4?丁三醇的發酵生產。本發明方法簡單，可靠性強，應用前景廣。

技術領域

本發明涉及2-酮基-3-脫氧-d-木糖酸的制備技術領域，具體涉及一種提高木糖酸脫水酶活性的基因工程菌及其構建方法與應用。

背景技術

SufA、HscB、ScdA蛋白屬于涉及鐵-硫簇生物合成的復雜蛋白質機器。它們被定義為支架蛋白，預組裝的簇從其轉移至靶載脂蛋白。

鐵硫蛋白是最古老，高度保守的大分子之一。?它們在多種生物過程中起作用，包括鐵穩態，電子轉移，氧化還原和非氧化還原催化，固氮，基因表達調節和氧物種檢測。盡管近年來生物[Fe-S]簇的化學反應性和光譜性質已被廣泛表征，但其生物合成的機制尚處于探索的早期階段。實際上，生物合成過程中，確定比例的鐵和硫原子從其儲存源中被動員并以受控方式組合以產生各種[Fe-S]簇，這需要復雜的蛋白質機制。

D-木糖酸脫水酶，系統命名是D-木糖酸氫-裂解酶，能催化木糖酸脫水反應。屬于IlVD/EDD蛋白質家族，IlvD指支鏈氨基酸生物合成途徑中的脫水酶，EDD指Entner-Doudoroff途徑中的脫水酶，其代替一些細菌中的經典糖酵解。據報道，屬于IlvD?/?EDD家族的酶在蛋白質結構中含有[2Fe-2S]或[4Fe-4S]簇，并且D-木糖酸脫水酶一直存在底物消耗緩慢的缺點，由于鐵和硫原子無法在生物合成過程中從其儲存源中被動員起來，因此在細胞反應過程中底物消耗緩慢添加一些有利于鐵硫簇參與反應的操縱子系統的蛋白，以此來提高催化效率。

2-酮基-3-脫氧-d-木糖酸為生產D-1?,2?,4-丁三醇的中間產物，也是木糖酸脫水酶以木糖酸為底物時的產物，也是產D-1?,2?,4-丁三醇第三個酶的底物。通過提高了木糖酸脫水酶的活性，進而促進了木糖酸的消耗并提高了2-酮基-3-脫氧-d-木糖酸的產量，最后提高了D-1，2，4-丁三醇的發酵生產。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種提高木糖酸脫水酶活性的基因工程菌及其構建方法與應用，該工程菌構建方法簡單，能夠產生有利于鐵硫簇參與反應的操縱子系統的蛋白，提高了木糖酸脫水酶的活性，并進一步提高了D-木糖酶脫水酶對底物的消耗，最后可用于產丁三醇的領域。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種提高木糖酸脫水酶活性的基因工程菌，構建克隆表達鐵硫簇插入蛋白SufA基因，并將構建好的基因轉入宿主菌內得基因工程菌，所述基因工程菌用于發酵生產D-1?,2,4-丁三醇的中間產物2-酮基-3-脫氧-d-木糖酸。

作為改進的是，所述的鐵硫簇插入蛋白SufA基因來自大腸桿菌MG1655，且核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述的木糖酸脫水酶的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

作為優選，所述的宿主菌為大腸桿菌Trans?1?T1。

上述提高木糖酸脫水酶活性的基因工程菌的構建方法，包括如下步驟：步驟1，將木糖酸脫水酶基因的兩端插入酶切位點NcoⅠ與Hind?Ⅲ，然后將酶切后的木糖酸脫水酶基因克隆到質粒一中，得到重組質粒一；將鐵硫簇插入蛋白SufA基因的兩端插入酶切位點EcoRⅠ與KpnⅠ,然后將酶切后的鐵硫簇插入蛋白SufA基因克隆到質粒二中；得到重組質粒二；步驟2，將重組質粒一和重組質粒二共同轉入宿主菌內，即得到了基因工程菌E.coliT1-pCWJ-yjhG-pTRC99A-SufA。

作為改進的是，質粒一為pCWJ質粒，質粒二為pTRC99A質粒。