[發明專利]一種提高木糖酸脫水酶活性的基因工程菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201911036211.X
• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN110591997B
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 王昕;陳可泉;麥丹丹
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/60;C12N15/31;C12P7/18;C12R1/19
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 葉帥東

1.一種提高木糖酸脫水酶活性的基因工程菌，其特征在于，構建克隆表達鐵硫簇插入蛋白SufA基因，?并將構建好的基因轉入宿主菌內得基因工程菌，所述基因工程菌用于發酵生產D-1?,2?,4-丁三醇的中間產物2-酮基-3-脫氧-d-木糖酸，所述的鐵硫簇插入蛋白SufA基因來自大腸桿菌MG1655，且核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示；用于擴增SufA基因的引物的正向引物如SufA-EcoR?I-F所示：CCGGAATTCCGGATGGACATGCATTC，

反向引物如SufA-Kpn?I-R所示：CGGGGTACCCCGTTAGCTAAGTGCAG；

所述的木糖酸脫水酶的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.10所示；所述的宿主菌為大腸桿菌Trans?1?T1，所述提高木糖酸脫水酶活性的基因工程菌的構建方法，包括如下步驟：步驟1，將木糖酸脫水酶基因的兩端插入酶切位點NcoⅠ與Hind?Ⅲ，然后將酶切后的木糖酸脫水酶基因克隆到質粒一中，得到重組質粒一；將鐵硫簇插入蛋白SufA基因的兩端插入酶切位點EcoRⅠ與KpnⅠ,然后將酶切后的鐵硫簇插入蛋白SufA基因克隆到質粒二中；得到重組質粒二；步驟2，將重組質粒一和重組質粒二共同轉入宿主菌內，即得到了基因工程菌E.coliT1-pCWJ-yjhG-pTRC99A-SufA其中，質粒一為pCWJ質粒，質粒二為pTRC99A質粒。

2.基于權利要求1所述的提高木糖酸脫水酶活性的基因工程菌在以D-木糖酸為底物產1,2，4-丁三醇上的應用，其特征在于，包括如下步驟：第一步，培養基因工程菌E.coliT1-pCWJ-yjhG-pTRC99A-SufA；第二步，收培養后的基因工程菌，接種到發酵培養基中，加入D-木糖酸和IPTG誘導反應體系發酵產D-1,2,4-丁三醇，所述的反應體系包括如下組分：D-木糖酸的添加量為20g/L，菌體OD₆₀₀為60，置于33℃搖床反應17h。