[發明專利]通過基因編輯創制廣譜抗細條病作物新種質的方法及其應用

在審

• 申請號: 201911035381.6
• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN110747222A
• 公開（公告）日: 2020-02-04
• 發明（設計）人: 黃大輝;秦鋼;張月雄;馬增鳳;劉馳;岑貞陸;韋敏益;羅同平;李振經;韋維
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 11340 北京天奇智新知識產權代理有限公司
• 代理人: 王雪

本發明公開一種通過基因編輯創制廣譜抗細條病作物新種質的方法及其應用，對水稻OsMPK6基因全長cDNA進行克隆，利用CRISPR/Cas9技術對OsMPK6進行編輯，構建轉基因載體，利用農桿菌介導法進行轉基因，獲得T0轉基因陽性苗，通過測序和野生型的目的片段進行比對確定所得轉基因陽性苗目的基因已被編輯，種植T0轉基因苗，利用分子標記輔助選擇，獲得基因型純合的T1代轉基因苗，對T1、T2代轉基因苗進行人工接種鑒定，若表現出廣譜細條病抗性，則獲得了廣譜抗細條病的水稻新種質。本發明利用基因編輯技術，對細條病抗性主效基因BLS1(OsMPK6)進行修飾，創制廣譜抗細條病新種質，可以大大提高這一種重要資源的利用效率。

【技術領域】

本發明涉及基因編輯技術進行農作物育種技術領域，尤其是一種通過基因編輯創制廣譜抗細條病作物新種質的方法及其應用。

【背景技術】

細菌性條斑病(簡稱細條病)由病原菌Xanthomonas oryze pv.Oryzicola(Xoc)引起，是一種重要的水稻病害。該病害在爆發流行年份可導致水稻產量損失32％。栽培措施和農藥使用是防治細條病的有效辦法。但是，利用抗性資源培育抗性品種是防治該病害最為經濟有效的辦法。以優良抗性基因資源為對象，利用基因編輯等分子生物技術來提高育種效率有重要意義。目前關于利用基因編輯創制廣譜抗細條病新種質的研究尚很少見。

稻種中抗細條病資源較豐富，但多數抗源主要來自熱帶地區，且大都是一些古老的地方品種，農藝性狀比較差，因此，單靠常規育種方法改良，周期長，資源利用效率低。此外，對抗源開發力度不足，也是造成抗細條病育種進展緩慢的原因之一。細條病抗源中，主效基因控制的抗性是一種重要的抗源類型。

【發明內容】

鑒于上述內容，本申請提供了一種通過基因編輯創制廣譜抗細條病作物新種質的方法及其應用，對細條病抗性主效基因BLS1(OsMPK6)進行修飾，創制廣譜抗細條病新種質，可以大大提高這一種重要資源的利用效率。

為達到上述目的，本發明所采用的技術方案是：

一種通過基因編輯創制廣譜抗細條病新種質的方法，對水稻OsMPK6基因全長cDNA進行克隆，利用CRISPR/Cas9技術對基因OsMPK6進行編輯，構建轉基因載體，利用農桿菌介導法進行轉基因，將獲得的T0轉基因陽性苗，通過測序和野生型的目的片段進行比對確定所得轉基因陽性苗目的基因已被編輯，種植T0轉基因苗，利用分子標記輔助選擇，獲得基因型純合的T1代轉基因苗，對T1、T2代轉基因苗進行人工接種鑒定，若表現出廣譜細條病抗性，則獲得了廣譜抗細條病的水稻新種質。

進一步說明，對水稻OsMPK6基因全長cDNA進行克隆步驟中，反轉錄cDNA，使用的引物序列如：左端引物序列cagtggtctcacaacatggacgccggggcgcagcc，左端引物序列：cagtggtctcatacactggtaatcagggttgaacg。

進一步說明，構建的轉基因載體，設計的載體構建靶標引物分別如下：

(1)第1靶標引物：

7082-Y+：cagtggtctca ggca ctggatgaacctcccgcca；

7082-Y-：cagtggtctca aaac tggcgggaggttcatccag；

(2)第2靶標引物：

7082-B+：cagtggtctca ggca agccccccatcctccccat；