[發明專利]通過基因編輯創制廣譜抗細條病作物新種質的方法及其應用

在審

• 申請號: 201911035381.6
• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN110747222A
• 公開（公告）日: 2020-02-04
• 發明（設計）人: 黃大輝;秦鋼;張月雄;馬增鳳;劉馳;岑貞陸;韋敏益;羅同平;李振經;韋維
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 11340 北京天奇智新知識產權代理有限公司
• 代理人: 王雪

1.一種通過基因編輯創制廣譜抗細條病新種質的方法，其特征在于，通過對水稻OsMPK6基因全長cDNA進行克隆，利用CRISPR/Cas9技術對基因OsMPK6進行編輯，構建轉基因載體，利用農桿菌介導法進行轉基因，獲得T0轉基因陽性苗，通過測序和野生型的目的片段進行比對確定所得轉基因陽性苗目的基因已被編輯，種植T0轉基因苗，利用分子標記輔助選擇，獲得基因型純合的T1代轉基因苗，對T1、T2代轉基因苗進行人工接種鑒定，若表現出廣譜細條病的抗性，則獲得了廣譜抗細條病的水稻新種質。

2.根據權利要求1所述的通過基因編輯創制廣譜抗細條病新種質的方法，其特征在于：對水稻OsMPK6基因全長cDNA進行克隆步驟中，反轉錄cDNA，使用的引物序列如：左端引物序列cagtggtctcacaacatggacgccggggcgcagcc，左端引物序列：cagtggtctcatacactggtaatcagggttgaacg。

3.根據權利要求1所述的通過基因編輯創制廣譜抗細條病新種質的方法，其特征在于：構建的轉基因載體，設計的載體構建靶標引物分別如下：

(1)第1靶標引物：

7082-Y+：cagtggtctcaggcactggatgaacctcccgcca；

7082-Y-：cagtggtctcaaaactggcgggaggttcatccag；

(2)第2靶標引物：

7082-B+：cagtggtctcaggcaagccccccatcctccccat；

7082-B-：cagtggtctcaaaacatggggaggatggggggct。

4.根據權利要求1所述的通過基因編輯創制廣譜抗細條病新種質的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)定位候選基因：將BLS1定位在RM19400和RM510之間21-kb的物理范圍內，登錄RiceGenome Annotation Project網站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，查詢定位區域(Chr.6 2810860-2831635)，得到精細定位區域包含OsMPK6基因(LOC_Os06g06090)、二氫新喋呤醛縮酶(LOC_Os06g06100)、轉座子(LOC_Os06g06110)和未知基因(LOC_Os06g06115)4個候選基因；

(2)候選基因表達分析：以抗感親本和后代植株為材料，分別接種細條病菌后，在不同時間點取樣提取RNA，逆轉錄成cDNA，對定位區域內的候選基因進行表達分析，選擇出與細條病抗性有關的基因；

(3)精細定位區域測序：使用Agilent捕獲平臺，將水稻材料DP3、9311、708-2和810進行精細定位區域及側翼200kb范圍進行測序，獲得目標區段大量的數據供生物信息學分析，利用IGV軟件對精細定位測序結果進行對比分析，發現在OsMPK6基因區域抗感親本和抗感后代單株之間存在豐富的基因結構差異；

(4)候選基因cDNA克隆：利用設計的引物反轉錄cDNA，對候選基因OsMPK6全長CDNA進行克隆，獲得抗病植株DP3和708-2和感病植株9311和810的序列；

(5)利用CRISPR/Cas9基因編輯構建轉基因載體：選擇對細條病的抗性介于普通DP3和9311之間的基因編輯材料708-2，然后通過PCR擴增、酶切連接、測序分析構建轉基因載體；

(6)轉基因苗獲得：利用農桿菌介導法轉基因，得到23個株系的T0陽性苗；提取T0陽性苗的基因組DNA，用目標基因引物對T0陽性苗進行PCR檢測，對擴增的PCR產物進行測序，將測序結果和野生型的目的片段進行比對確定所得轉基因苗目的基因已被編輯，種植T0轉基因苗，利用目標基因引物檢測，獲得基因型純合的T1代轉基因苗；

目標基因引物：7082-6200+：cacctgctcccccgtctc，7082-6633-：cctccactttcccttccc；

(7)廣譜多抗細條病新種質創制：通過人工接種鑒定，從T1代轉基因苗，篩選獲得比野生型708-2表現出更好的抗性的株系E136-27-1；功能互補實驗說明OsMPK6基因(LOC_Os06g06090)就是目的基因BLS1；利用蛋白質免疫印跡(Western Blot,WB)技術對E136-27-1的后代V902進行檢測，發現V902與野生型708-2相比目標蛋白OSMPK6翻譯量大大減少；利用細條病菌I型菌(菌株號為QC-1)、II型菌(菌株號為HG-3)和III型菌(菌株號為JZ-8)對V902與野生型708-2進行接種鑒定，發現V902比野生型708-2具有廣譜細條病抗性，證明獲得了廣譜抗細條病創新種質。

5.權利要求1-4任一所述的通過基因編輯在創制廣譜抗細條病水稻新種質中的應用。