[發(fā)明專利]一種真菌來(lái)源的重組巖藻糖特異性凝集素r-AofleA及其表達(dá)菌株和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911035324.8
• 申請(qǐng)日: 2019-10-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110903362A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-03-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王永中;田東蕊;張麗;孔小衛(wèi);盛康亮;汪靜敏;張敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/37
• 分類號(hào): C07K14/37;C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;G01N33/68;G01N33/574;C12R1/19
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責(zé)任公司 34101
• 代理人: 喬恒婷

1.一種真菌來(lái)源的重組巖藻糖特異性凝集素r-AofleA，其特征在于：

所述重組巖藻糖特異性凝集素r-AofleA的原始來(lái)源為捕食線蟲(chóng)性真菌Arthrobotryoligosopra，其具有下列氨基酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID No：1；

(2)序列表中的SEQ ID No：1經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基且編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列；

(3)與序列表中的SEQ ID No：1具有80％以上同源性的突變氨基酸序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組巖藻糖特異性凝集素r-AofleA，其特征在于：

所述重組巖藻糖特異性凝集素r-AofleA是由343氨基酸組成，分子量為38.1KDa，等電點(diǎn)為6.15。

3.編碼權(quán)利要求1或2所述的重組巖藻糖特異性凝集素r-AofleA的編碼基因，其特征在于具有如下核苷酸之一：

(1)序列表中的SEQ ID No：2；

(2)序列表中的SEQ ID No：2經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸殘基且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；

(3)編碼序列表中SEQ ID No：1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；

(4)與序列表中的SEQ ID No：2具有80％以上同源性的突變核苷酸序列。

4.一種權(quán)利要求1或2所述的重組巖藻糖特異性凝集素r-AofleA的重組表達(dá)菌株，其特征在于：

所述重組表達(dá)菌株的分類命名為：大腸桿菌BL21(DE3)pET28a-AofleA，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏日期：2019年10月8日，保藏編號(hào)：CCTCC NO：M 2019774。

5.權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)菌株的制備方法，其特征在于：

首先采用合適的引物P1和P2通過(guò)RT-PCR對(duì)r-AofleA基因進(jìn)行分子克隆，制備克隆載體pUC19-AofleA；然后通過(guò)Nco I和Not I限制性內(nèi)切酶將AofleA基因連接到表達(dá)載體上，制備重組表達(dá)載體；隨后將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主，獲得可重組表達(dá)r-AofleA的工程菌株。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：

所述引物P1的核苷酸序列為SEQ ID No：3，所述引物P2的核苷酸序列為SEQ ID No：4。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：

所述表達(dá)載體為pCold、pET15、pET22、pET28或pET30；

所述表達(dá)宿主為E.coli BL 21(DE3)、E.coli DH5α或E.coli Rosetta。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于：

所述表達(dá)載體為pET28a，所述表達(dá)宿主為大腸桿菌BL 21(DE3)。

9.通過(guò)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)菌株制備重組巖藻糖特異性凝集素r-AofleA的方法，其特征在于包括如下步驟：

步驟1：將所述重組表達(dá)菌株接種到含卡那霉素LB培養(yǎng)基中，于溫度37℃、220rpm搖床震蕩培養(yǎng)8-12h；

步驟2：將步驟1獲得的菌液取4ml轉(zhuǎn)接到100ml-5L LB/Kan液體培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)至OD＝0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為0.4mM IPTG，在16℃、220rpm搖床上誘導(dǎo)培養(yǎng)18h；

步驟3：取步驟2獲得的培養(yǎng)液5500g，4℃下離心10min，收集菌體并重懸于含有25mmol/L Tris-HCl、10mmol/L咪唑和0.5M NaCl的緩沖液中；

步驟4：超聲處理破碎細(xì)胞，10,000g，4℃離心40min，將獲得的上清液加到Ni NTA-agarose親和柱上，用20mmol/L咪唑緩沖液洗滌雜蛋白；

步驟5：用40-500mmol/L咪唑緩沖液分級(jí)洗脫目的蛋白，獲得純化的rAoFleA蛋白。

10.權(quán)利要求1或2所述的重組巖藻糖特異性凝集素r-AofleA的應(yīng)用，其特征在于：是在制備用于檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體L3相對(duì)含量AFP-L3％的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用；具體是將所述重組巖藻糖特異性凝集素r-AofleA與甲胎蛋白AFP單抗建立夾心法ELISA測(cè)定不同生物樣品中甲胎蛋白異質(zhì)體比例AFP-L3％，所用的r-AofleA與AFP單抗?jié)舛确秶?.1μg/ml-1000μg/ml。