[發明專利]用于檢測核酸PAP擴增的焦磷酸化激活性熒光

在審

• 申請號: 201911035316.3
• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN111172245A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 丁少峰;劉強
• 申請（專利權）人: 丁少峰;劉強
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 曹玉平

本發明涉及用于測定核酸PAP擴增的焦磷酸化激活性熒光的全新熒光檢測方法。熒光基團?淬滅基團雙標記阻斷性引物用于PAP反應，該引物的內部區域或5'末端核苷酸帶有一個熒光基團，3'末端阻斷性核苷酸則帶有一個淬滅基團。多個熒光基團?淬滅基團雙標記阻斷性引物也用于多重PAP反應，這些引物則帶有不同的熒光基團用以區分一個反應中的多個模板。

序列表

本申請同時提交序列表。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別涉及焦磷酸化激活性聚合反應(Pyrophosphorolysis activated polymerization,PAP)核酸擴增。

背景技術

焦磷酸化激活性聚合反應(PAP)

焦磷酸化激活性聚合反應(Pyrophosphorolysis activated polymerization,PAP)是一種使用3'末端阻斷性引物，利用DNA聚合酶催化焦磷酸化反應串聯耦合聚合反應的一種核酸擴增方法(Liu and Sommer,2000；Liu and Sommer,2004b)。其引物在3'末端由具有不可延伸性的核苷酸(3'末端阻斷劑)如雙脫氧核苷酸所封閉,因此不能直接被DNA聚合酶所延伸。當3'末端阻斷性引物與其互補性DNA模板雜交時，在焦磷酸或其類似物的存在下DNA聚合酶可以去除3'末端阻斷性引物上的3'末端阻斷劑，這一反應稱為焦磷酸化反應。然后DNA聚合酶能沿著已去除3'末端阻斷劑的引物而延伸DNA模板,這一反應稱為聚合反應。除了本文所引用的參考文獻，PAP已經在美國專利6,534,269,7,033,763,7,105,298,7,238,480,7,504,221,7,914,995和7,919,253中所描述。

在PAP中使用了3'末端阻斷性引物，使得焦磷酸化反應和聚合反應的串聯耦合具有極高的選擇性(Liu and Sommer,2004a；Liu and Sommer,2004b)，因為一個顯著的可導致假陽性的非特異性擴增(第二類錯誤)需要錯配性焦磷酸化反應加上隨后發生的由DNA聚合酶而產生的錯誤摻入性延伸反應,因此這種串聯錯誤事件的發生概率估計為3.3×10^-11。

雙向形式的PAP(Bi-PAP)特別適用于等位基因的特異性擴增，它使用兩個相對應的3'末端阻斷性引物，其3'末端的單個核苷酸相互重疊(Liu and Sommer，2004a；Liu andSommer，2004b)。Bi-PAP可以在10⁹個野生型DNA模板存在的情況下檢測到一個拷貝等位基因的突變而沒有假陽性擴增。

DNA-PAP

PAP的最初測試采用了人類多巴胺D1基因DNA模板并使用了Tfl和Taq聚合酶，證明了DNA依賴性DNA焦磷酸化反應和DNA依賴性DNA聚合反應可以串聯耦合(Liu and Sommer,2000)。當使用一個經過基因工程改造含有F667Y突變的DNA聚合酶TaqFS時可大大提高PAP的效率，這已被應用于其它DNA模板時所證明(Liu and Sommer,2002)。

RNA-PAP

此后發明的RNA-PAP可直接擴增RNA模板而無需額外的制備。RNA-PAP開創了RNA模板擴增的新機制，其中RNA依賴性DNA焦磷酸化反應移除了雜交于RNA模板上阻斷性引物的3'末端阻斷劑如3'末端雙脫氧核苷酸，然后RNA依賴性DNA聚合反應則延伸被激活的引物。基于這種串聯偶聯，RNA-PAP對RNA模板上的不匹配的阻斷性引物具有高度的選擇性，導致了RNA模板的高度特異性擴增(美國專利號9,133,491)。

使用無環核苷酸為阻斷劑及II型聚合酶