[發明專利]一種檢測降鈣素原的電化學免疫傳感器的制備方法

有效

• 申請號: 201911034983.X
• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN110794017B
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 賈洪英;鞠熀先;魏琴;丁慧;范大偉;張勇;孫旭;曹偉;王雪瑩;姜娜;匡軒;王斌
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/30;G01N33/68
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 趙鳳

1.一種檢測降鈣素原的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于，電化學免疫傳感器的制備包括以下步驟：

（1）將直徑為4 mm的玻碳電極分別用0.05、0.3和1.0 mm氧化鋁粉打磨拋光至鏡面，再用超純水洗滌干凈；

（2）鉑納米粒子功能化花狀氧硫化銅是利用400 μL鉑納米粒子和2 mL的2.0 mg/mL氧硫銦化銅室溫下振蕩24 h，離心，溶解于2 mL的去離子水；

（3）將6 μL、濃度為1.0 ~ 3.0 mg/mL的鉑納米粒子功能化氧硫化銅溶液滴涂到電極表面，室溫保存至干燥；

（4）繼續滴涂6 μL、濃度為10 μg/mL的降鈣素原抗體標準溶液于玻碳電極表面，4 oC冰箱中保存至干燥，超純水清洗；

（5）繼續滴涂3 μL、質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液來封閉非特異性活性位點，4 oC冰箱中保存至干燥，超純水清洗；

（6）繼續將6 μL、濃度為1.0 fg/mL～50.0 ng/mL的一系列不同濃度的降鈣素原抗原標準溶液滴涂在電極表面，4 oC冰箱中保存至干燥，超純水清洗；

其中，花狀氧硫化銅的制備步驟為：

在磁力攪拌的條件下，將4.0 g～5.0 g 三水合硝酸銅加入到500 mL水溶液中；再將1.0 g~2.0 g硫代乙酰胺加入到500 mL溶液中；30 min后，將該溶液加熱到90 oC；接下來再加入0.1～0.2 mL肼攪拌2 h后得到沉淀固體，用去離子水洗滌直至洗滌液的pH為7后再用乙醇清洗數次去除有機物；將所得固體樣品放在真空干燥箱中50 oC下干燥24 h，研磨后得到花狀氧硫化銅納米材料；

鉑納米粒子的制備步驟為：

鉑納米粒子是通過將四氯鉑酸鉀溶液加入到抗壞血酸和溴化鉀的溶液中還原制備的；將105 mg的聚乙烯吡咯烷酮，40 mg～60 mg的抗壞血酸和400 mg～600 mg的溴化鉀溶解在去離子水中, 將該溶液用油浴加熱到90 oC，并且保持10 min；然后用滴管逐滴加入含40mg～60 mg的四氯鉑酸鉀的3.0 mL水溶液中，并且將這一反應在80 oC保持3 h，洗滌離心后將其溶解在10 mL的去離子水中；

鉑納米粒子功能化花狀氧硫化銅納米材料的制備步驟為：

將400 μL的鉑納米粒子溶液加入到 2 mL的2.0 mg/mL的氧硫化銅溶液中，在室溫下振蕩24 h, 離心分離后的產物經多次水洗去除多余的鉑納米粒子，再分散于2 mL去離子水中得到鉑納米粒子功能化花狀氧硫化銅溶液。

2.如權利要求1所述的一種檢測降鈣素原的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述的1.0 fg/mL～50.0 ng/mL的一系列不同濃度的降鈣素原抗原標準溶液為1 mg/mL的降鈣素原溶液用磷酸鹽緩沖溶液稀釋得到。

3.如權利要求1所述的一種檢測降鈣素原的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于，降鈣素原的檢測步驟如下：

（1）使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極，所制備的一種檢測降鈣素原的電化學免疫傳感器為工作電極，在10 mL的pH 為4.0～9.0磷酸鹽緩沖溶液中測定其電流變化；

（2）電化學工作站參數設置為，循環伏安掃描電位為-0.6~0.2 V，掃描速率設置為0.1V/s；

（3）使用含10 μL濃度為5 mmol/L過氧化氫的10 mL磷酸鹽緩沖溶液作為底液，通過計時電流方法檢測不同濃度的降鈣素原產生的電化學電流信號強度；所述磷酸鹽緩沖溶液，其pH為7.4，用0.1 mol/L磷酸氫二鈉和0.1 mol/L磷酸二氫鉀配制；

（4）根據所得電流差值與降鈣素原濃度呈線性關系，繪制工作曲線；

（5）依據工作曲線的繪制方法進行樣品中降鈣素原的檢測，檢測結果從工作曲線中查得。