[發明專利]一種應用實時熒光RT-PCR定量檢測羅湖病毒的方法

在審

• 申請號: 201911034243.6
• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN110616281A
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 周偉光;李天寶;張展;曾麗珠
• 申請（專利權）人: 周偉光
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 50230 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 陳炳萍

本發明公開了一種應用實時熒光RT?PCR定量檢測羅湖病毒的方法，具體涉及羅湖病毒檢測技術領域，具體步驟如下：S1、羅湖病毒的分離；S2、樣品中病毒RNA的提??；S3、RT?PCR檢測方法的建立；S4、實時熒光定量PCR檢測方法的建立；S5、建立形態解剖學特征鑒定感病個體的方法。本發明通過建立該病毒分子生物學檢驗鑒定方法，可為水產養殖加工和貿易企業提供此類病毒檢測服務并出具檢驗報告，同時可為政府監管部門開展疫情監測和防治提供技術服務，并且參與官方及水產企業的防疫防控工作并提供技術支持和疫情確認，另外待檢測方法建立后，可以與水產養殖企業和防治藥劑生產企業合作，研制羅湖病毒預防和治療的藥劑，具有廣闊的發展前景。

技術領域

本發明涉及羅湖病毒檢測技術領域，更具體地說，本發明涉及一種應用實時熒光RT-PCR定量檢測羅湖病毒的方法。

背景技術

羅非魚是一種非常重要的食用魚類，世界第二大水產養殖品種。2015年世界羅非魚養殖和捕撈產量達到640萬噸，價值約98億美元，全球貿易額達18億美元，2016年和2017年產量持續增長，作為一種重要的動物性蛋白來源，羅非魚具有分布范圍廣、適應能力強、生長周期短、食性廣泛、抗病性強等優點，被認為是全球糧食安全和營養的“支柱”之一，為包括許多小農在內的千百萬人提供糧食、就業及國內和出口收入。

近期，聯合國糧農組織發布羅非魚羅湖病毒(TiLV)特別警報，在全球六個國家發生羅湖病毒疫情，殃及南美、亞洲和中東地區，目前，尚不確定羅湖病毒是否會通過冷凍羅非魚產品進行傳播，但糧農組織指出，羅湖病毒有可能比目前已知的分布范圍更廣，給全球羅非魚養殖造成嚴重威脅，羅湖病毒在24-33℃均可以生長，最適溫度25℃，所以每年的5-10月份均可能導致發病，糧農組織(FAO)指出，羅非魚生產國需要保持警惕，在開展羅非魚貿易時應遵守世界動物衛生組織《水生動物衛生法典》，這些國家應該實施主動監測計劃，以確定是否存在羅湖病毒，其感染的地理范圍，并確定有助于遏制傳播的風險因素，佛羅里達大學養殖學專家CraigWatson表示，世界動物衛生組織(OIE)將羅湖病毒列為“須報告病毒”的可能性非常大。一旦實施，水產進口國將對易感染的品種展開進口檢驗，如活魚。另據陽江本市多家羅非魚出口廠家反饋，目前出口非洲科特迪瓦等國家的羅非魚要求出具中國官方檢疫合格證書。

鑒于羅非魚在我國及全球巨大的經濟意義，以及羅湖病毒嚴重的危害性，世界多國已經將其列為產品入境的檢疫項目，但目前在公開發表的文獻中尚無羅湖病毒檢疫鑒定方法，也尚未有有效的治療方法，根據目前的研究現狀，對于羅湖病毒的系統性研究尚不夠深入，相關免疫學、分子生物學檢測方法尚未正式建立，鑒于該病毒的傳播性及危害性較大，有必要開展其流行傳播情況的調查研究，并需快速篩查及準確鑒定方法的技術支持，故需要一種應用實時熒光RT-PCR定量檢測羅湖病毒的方法。

發明內容

為了克服現有技術的上述缺陷，本發明的實施例提供一種應用實時熒光RT-PCR定量檢測羅湖病毒的方法，通過建立該病毒分子生物學檢驗鑒定方法，可為水產養殖加工和貿易企業提供此類病毒檢測服務并出具檢驗報告，同時可為政府監管部門開展疫情監測和防治提供技術服務，并且參與官方及水產企業的防疫防控工作并提供技術支持和疫情確認，另外待檢測方法建立后，可以與水產養殖企業和防治藥劑生產企業合作，研制羅湖病毒預防和治療的藥劑，具有廣闊的發展前景。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種應用實時熒光RT-PCR定量檢測羅湖病毒的方法，具體步驟如下：

S1、羅湖病毒的分離：

S1.1、可疑病例樣品的處理方式：采集到的疑似樣品需在配置一半以上體積冰袋、保溫效果良好的保溫箱中低溫運輸，溫度保持在0-4℃；

S1.2、病毒的分離方法：在實驗室無菌條件下獲取疑似病例個體的肝、腎、脾、腸、腮和腦組織，用組織研磨機將樣品勻漿成糊狀，按照1：10的稀釋度懸于適當的細胞培養液中，于30-37℃下孵育10-15min后放入離心機進行離心處理，離心后吸取包含細胞的上清液放入EP管中；