[發明專利]一種應用實時熒光RT-PCR定量檢測羅湖病毒的方法

在審

• 申請號: 201911034243.6
• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN110616281A
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 周偉光;李天寶;張展;曾麗珠
• 申請（專利權）人: 周偉光
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 50230 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 陳炳萍

1.一種應用實時熒光RT-PCR定量檢測羅湖病毒的方法，其特征在于：具體步驟如下：

S1、羅湖病毒的分離：

S1.1、可疑病例樣品的處理方式：采集到的疑似樣品需在配置一半以上體積冰袋、保溫效果良好的保溫箱中低溫運輸，溫度保持在0-4℃；

S1.2、病毒的分離方法：在實驗室無菌條件下獲取疑似病例個體的肝、腎、脾、腸、腮和腦組織，用組織研磨機將樣品勻漿成糊狀，按照1：10的稀釋度懸于適當的細胞培養液中，于30-37℃下孵育10-15min后放入離心機進行離心處理，離心后吸取包含細胞的上清液放入EP管中；

S2、樣品中病毒RNA的提取：使用CTAB法或者商業試劑盒提取病毒RNA；

S3、RT-PCR檢測方法的建立：

S3.1、根據Genbank中登記的羅湖病毒設計上下游引物；

S3.2、對提取取得的RNA進行逆轉錄，合成DNA后進行核酸擴增和鑒定；

S4、實時熒光定量PCR檢測方法的建立：

S4.1、根據Genbank中登記的羅湖病毒基因NC_029930特異序列設計引物和探針；

S4.2、根據DNA序列，合成單鏈小片段DNA，再通過PCR方法，把單鏈小片段DNA拼接成一條完整的雙鏈DNA片段，合成NC_029930(Tipapia)基因(465bp)，將合成的基因片段連接至pMD19-T載體中，構建陽性質粒；取In-Fusion產物轉化至E.coli Competent Cell JM109保存備用；

對E.coli Competent Cell JM109菌落用M13-47/RV-M引物進行PCR，檢測所含質粒中插入片段的長度大小；

對E.coli Competent Cell JM109菌落進行質粒DNA提取，測序，以驗證陽性質粒序列；

S4.3、在無法取得羅湖病毒陽性樣本的情況下，陽性質粒可以作為檢測實驗的陽性對照使用；

S4.4、利用陽性質粒為模板、設計的引物和探針進行擴增，驗證引物、探針、模板的正確性；

S4.5、對擴增產物進行基因測序，錄入Genbank進行比對，確認為羅湖病毒特異性序列；

S4.6、經實驗確認，引物、探針設計；陽性對照構建，均有效。該項檢測方法可對羅湖病毒進行分子生物學鑒定；

S5、建立形態解剖學特征鑒定感病個體的方法：通過上述方法最終建立形態解剖學和分子生物學方法結合的羅湖病毒檢疫鑒定方法。

2.根據權利要求1所述的一種應用實時熒光RT-PCR定量檢測羅湖病毒的方法，其特征在于：在步驟S1.2中可依據細胞培養結果考慮是否需要加入抗生素以防治污染，提高細胞成活率。

3.根據權利要求1所述的一種應用實時熒光RT-PCR定量檢測羅湖病毒的方法，其特征在于：在步驟S1.2中離心溫度為0-4℃，離心機轉速為8000-12000r/min，離心時間為10-15min。

4.根據權利要求1所述的一種應用實時熒光RT-PCR定量檢測羅湖病毒的方法，其特征在于：在步驟S3中使用雙標記熒光探針法，在步驟S3.1中設計的引物分別為：上游引物：TiLV-PFSeq：5'TCACCCCACTCTATATTATC3'，下游引物：TiLV-PRSeq：5'AGTCGGAAGATCAAGAAG3'，在步驟S4.1中設計的引物、探針：上游引物：TiLV-PFSeq：5'TCACCCCACTCTATATTATC3'，下游引物：TiLV-PRSeq：5'AGTCGGAAGATCAAGAAG3'，探針：(FAM)CCGCTCTCGTCAGCACCATA(TAMRA)。

5.根據權利要求1所述的一種應用實時熒光RT-PCR定量檢測羅湖病毒的方法，其特征在于：在步驟S3.2中也可以采用一步法，在一個反應體系內完成逆轉錄和擴增，根據設備及逆轉錄酶的特性，設計反應條件并進行優化。