[發明專利]一種用于檢測水稻惡苗病藤倉赤霉菌的RPA引物及檢測方法

在審

• 申請號: 201911033864.2
• 申請日: 2019-10-25
• 公開（公告）號: CN111378776A
• 公開（公告）日: 2020-07-07
• 發明（設計）人: 遲元凱;趙偉;戚仁德;葉夢迪;崔曉芳;汪濤
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 高寧馨

本發明公開了一種用于檢測水稻惡苗病病原藤倉赤霉菌的RPA引物及檢測方法，屬于生物安全技術領域。所述的RPA引物如下，RPA上游引物序列Ff?PRA?F如SEQ ID No.1所示，其下游引物序列Ff?PRA?R如SEQ ID No.2所示。本發明還提供基于所述RPA引物形成的檢測方法。本發明首次將RPA技術應用到藤倉赤霉菌的分子檢測，其兼具特異性強、靈敏度高、實用性好、對儀器設備要求較低的特點，為水稻惡苗病的早期診斷、病害防治和農藥減量使用提供新方法。

技術領域

本發明屬于生物安全技術領域，具體地說，涉及一種用于檢測水稻惡苗病病原藤倉赤霉菌的RPA引物及檢測方法。

背景技術

由藤倉赤霉菌(Fusarium fujikuroi)引起的水稻惡苗病是水稻上一種系統性侵染病害，發病嚴重的田塊可減產50％以上。另外，藤倉赤霉菌在侵染過程中會產生大量毒素，造成食品安全問題。傳統的藤倉赤霉菌的檢測方法主要包括有的形態學鑒定和基于PCR技術的分子檢測，但由于這些技術需要專業形態學知識，或診斷試劑長，或精密的科學儀器，不適合非專業人員操作，或在基礎設施和設備較落后的條件下使用，因此建立藤倉赤霉菌的快速診斷技術有十分重要的意義。

重組酶聚合酶等溫擴增的技術(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是一種核酸等溫擴增技術。利用RPA進行核酸檢測，僅需一對引物，在37℃-42℃的恒溫條件下反應10min-15min，即實現目的片段的特異性擴增，且在此過程中，無PCR儀等精密儀器。相比目前應用較多的環等溫擴增技術(LAMP)，PRA反應具有僅需一對引物，反應時間短，擴增后產生的單一目的條帶可用于測序等諸多有點，具有十分廣闊的應用前景，其被稱為可替代PCR的核酸檢測技術。

目前，RPA技術已廣泛應用于病毒、細菌、支原體和寄生蟲的快速檢測中，但尚未見其在藤倉赤霉菌檢測方面的報道。

發明內容

1、要解決的問題

針對藤倉赤霉菌尚無有效進行RPA技術檢測的問題，本發明提供一種用于檢測藤倉赤霉菌的RPA引物及檢測方法，它可以提高藤倉赤霉菌檢測的特異性和靈敏度，為水稻惡苗病的早期診斷提供新方法。

2、技術方案.

為解決上述問題，本發明采用如下的技術方案。

一種用于檢測水稻惡苗病病原藤倉赤霉的RPA引物，

所述的RPA引物的上游引物Ff-PRA-F如SEQ ID No.1所示，

所述的RPA引物的下游引物Ff-PRA-R如SEQ ID No.2所示；

一種用于檢測水稻惡苗病病原藤倉赤霉的檢測方法，

包括以下步驟：

(1)提取樣品中的DNA；

(2)以步驟(1)提取的DNA作為待檢測DNA模板，采用權利要求1所述的RPA引物，在RPA反應管中進行RPA擴增反應；

(3)分析RPA擴增產物。

上述用于檢測水稻惡苗病病原藤倉赤霉菌的檢測方法中，步驟(1)中所述的樣品為水稻植株樣本或待測病原菌培養物。

上述用于檢測水稻惡苗病病原藤倉赤霉菌的檢測方法中，所述的RPA引物的檢出下限為10pg DNA/μL。

上述用于檢測水稻惡苗病病原藤倉赤霉菌的檢測方法中，步驟(2)中RPA擴增反應的反應體系以50μL計為：

上述用于檢測水稻惡苗病病原藤倉赤霉菌的檢測方法中，步驟(2)中RPA擴增反應的反應條件為：37℃-39℃下反應20min-40min，隨后冰上終止反應。