[發明專利]一種金色裂葉樺的創制方法

有效

• 申請號: 201911031884.6
• 申請日: 2019-10-28
• 公開（公告）號: CN110734914B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 楊蘊力;劉桂豐;姜靜;冮慧欣;陳肅;顧宸瑞;李慧玉;黃海嬌;董京祥
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/82;A01H5/12;A01H6/00
• 代理公司: 北京盛詢知識產權代理有限公司 11901
• 代理人: 張海青

1.一種金色裂葉樺的創制方法，其特征在于，包括以下步驟：根據SEQ ID NO:1所示的BpGLK基因的保守序列，構建BpGLK基因的pGLKRNAi干擾表達載體，采用電擊法將所得的pGLKRNAi質粒轉入農桿菌感受態細胞中，篩選出陽性農桿菌，用所得陽性農桿菌侵染裂葉樺，使得轉基因裂葉樺中的BpGLK基因低量表達，葉片呈現黃色；

其中pGLKRNAi干擾表達載體具體構建方法，包括以下步驟：

步驟1：以野生型白樺的葉片cDNA為模板，BpGLK-F-BamHI和BpGLK-R-XbaI為引物，獲得BpGLK目的片段；BpGLK-F-BamHI引物如SEQ ID NO：3所示；BpGLK-R-XbaI的引物如SEQ IDNO：4所示；

步驟2：將所得BpGLK目的片段和pCAMBIA1300-GFP載體分別經BamHI和XbaI酶雙酶切后連接；連接產物轉化到大腸桿菌感受態細胞，得到陽性單克隆pCAMBIA1300-BpGLK-GFP；

步驟3：以pCAMBIA1300-BpGLK-GFP質粒為模板，PCR分別擴增BpGLK基因正向和反向目的片段；PCR擴增正向目的片段的引物如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；PCR擴增反向目的片段的引物如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；

步驟4：將步驟3所得的BpGLK正向目的片段和pFGC5941載體分別進行雙酶切后，連接并轉化大腸桿菌感受態細胞，獲取陽性單克隆pFGC5941-BpGLK-Cis；BpGLK反向目的片段與pFGC5941-BpGLK-Cis載體分別進行雙酶切后，連接并轉化大腸桿菌感受態細胞，獲取陽性單克隆pGLKRNAi。