[發明專利]一種分離和富集以及從頭組裝MHC基因的方法

有效

• 申請號: 201911027231.0
• 申請日: 2019-10-27
• 公開（公告）號: CN110777192B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 劉贇;邱文青;李陶陶;杜多;張丹丹
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

本發明屬于生物化學與分子生物學技術領域，具體為一種分離和富集以及從頭組裝人類主要組織相容性復合體基因的方法。本發明方法是基于CRISPR/cas9和脈沖場凝膠電泳（PFGE）系統，對MHC區域大片段DNA進行分離，對目標區域進行有效富集，利用10X Genomics平臺進行長片段DNA測序，通過基因的從頭組裝獲得N50 scaffold0.9 Mb的MHC單體型，并且覆蓋度達到整個4.6M MHC區域的90%以上；相較于傳統二代測序組裝技術，本發明方法具有明顯的優越性。

技術領域

本發明屬于生物化學與分子生物學技術領域，具體涉及一種從頭組裝人類主要組織相容性復合體基因的方法。

背景技術

主要組織相容性復合體（MHC）是由一組高度多態性基因組成的染色體區域，其基因產物在不同的細胞表面表達，稱之為MHC分子或MHC抗原，因這些抗原在器官移植中代表供受雙方的組織相容程度，亦稱為組織相容性抗原。人類主要組織相容性復合體為HLA基因系統，位于6號染色體短臂6p21.3區，是由一系列緊密連鎖的基因座位所組成的具有高度多態性的遺傳復合體，在人體免疫應答及免疫調節中起關鍵作用。

近年來許多研究表明，MHC基因與一些自身免疫病，如1型糖尿病、類風濕性關節炎、強直性脊柱炎、乳糜瀉等相關聯，同時一些感染性疾病如結核、麻風和HIV/AIDS等也與HLA有一定的關聯。大量的外顯子測序（WES）研究表明，在頭頸癌、鱗狀細胞肺癌、胃腺癌中發現HLA 1類基因的高頻體細胞突變。HLA復合體中很多基因座位的DNA序列在人群中存在許多變異體，也就是等位基因。HLA 1類基因具有豐富的等位基因，這些等位基因可以將內源性的抗原提呈到細胞表面，供細胞毒性T細胞識別殺傷。在一些癌癥的發展進程中，HLA基因的體細胞突變可能導致這一過程的紊亂從而形成免疫逃逸。因而在某些疾病中對于HLA等位基因的研究至關重要。

傳統的，確定HLA基因型的方法如血清學分型、細胞學分型等技術，由于分型抗體親和性低，缺乏單價抗血清以及操作繁瑣等原因，使得此類技術無法大規模應用。由于MHC區域各基因單倍型組合的高度多樣性以及不同水平的連鎖不平衡性，使得基于PCR的分型方法，如PCR-SSP、PCR-SSO 、PCR-SBT等技術無法滿足HLA單倍型分析的需要。另外，由于HLA基因GC堿基含量豐富，捕獲以及擴增效率低，在全基因組測序中，HLA區域覆蓋度低，導致一些重要的等位基因信息被丟失。而傳統的HLA捕獲測序由于基于已有的參考序列設計捕獲探針，會導致個體所特有的某些等位基因信息被忽略。

發明內容

本發明的目的在于提供一種不依賴已有的參考序列，能夠得到完整MHC單體型信息的分離和富集以及從頭組裝人類主要組織相容性復合體（MHC）基因的方法。

本發明提供的分離和富集以及從頭組裝MHC基因的方法，是基于CRISPR/cas9和脈沖場凝膠電泳（PFGE）系統，對MHC區域大片段DNA進行分離，對目標區域進行有效富集，利用10X Genomics平臺進行長片段DNA測序，通過基因的從頭組裝獲得N50 scaffold 0.9 Mb的MHC單體型，并且覆蓋度達到整個4.6M MHC區域的90%以上；具體步驟如下：

（1）將細胞包埋至低熔點（一般指熔點低于70℃）瓊脂糖中，通過制膠模具形成體積約為85ul，包含約1-5 x 10⁶個細胞的長方形膠塊，對膠塊內的細胞進行蛋白酶K消化處理；

（2）利用EnGen sgRNA試劑盒在體外轉錄合成sgRNA，利用CRISPR/cas9系統，體外37℃對膠塊內的DNA進行切割處理1-3小時，4℃反應終止處理1小時以上（例如為1-3小時）；

（3）利用脈沖場凝膠電泳系統分離MHC大片段DNA；

（4）將分離出的含有MHC 基因的膠塊放置在低熔點膠中進行電泳濃縮，利用瓊脂糖酶及透析膜回收分離出來的大片段DNA；

（5）Q-PCR檢測DNA富集效率，以及從頭組裝MHC序列，獲得HLA單倍型信息。