[發明專利]一種分離和富集以及從頭組裝MHC基因的方法

有效

• 申請號: 201911027231.0
• 申請日: 2019-10-27
• 公開（公告）號: CN110777192B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 劉贇;邱文青;李陶陶;杜多;張丹丹
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

1. 一種分離和富集以及從頭組裝MHC基因的方法，其特征在于，基于CRISPR/cas9和脈沖場凝膠電泳PFGE系統，對MHC區域大片段DNA進行分離，對目標區域進行有效富集，利用10X Genomics平臺進行長片段DNA測序，通過基因的從頭組裝獲得N50 scaffold 0.9 Mb的MHC單體型，并且覆蓋度達到整個4.6M MHC區域的90%以上；具體步驟如下：

（1）將細胞包埋至低熔點瓊脂糖中，通過制膠模具形成體積為85ul，包含1-5 x 10⁶個細胞的長方形膠塊，對膠塊內的細胞進行蛋白酶K消化處理；

（2）利用EnGen sgRNA試劑盒在體外轉錄合成sgRNA，利用CRISPR/cas9系統，體外37℃對膠塊內的DNA進行切割處理1-3小時，4℃反應終止處理1小時以上；

（3）利用脈沖場凝膠電泳系統分離MHC大片段DNA；

（4）將分離出的含有MHC 基因的膠塊放置在低熔點膠中進行電泳濃縮，利用瓊脂糖酶及透析膜回收分離出來的大片段DNA；

（5）Q-PCR檢測DNA富集效率，以及從頭組裝MHC序列，獲得HLA單倍型信息；

步驟（1）中所述細胞為GM12878、GM12891或GM12892細胞系，或者為各種組織分離出的細胞樣品；

步驟（2）中所述sgRNA的位置在MHC區域的兩端及中間，僅3處切割位置，確保得到兩段2.3M 的大片段MHC DNA，共同構成4.6M的完整MHC區域；

所述sgRNA序列信息如下表所示：

；

所述Q-PCR檢測DNA富集效率，Q-PCR引物如下表所示：

。