[發明專利]一種測定細胞基質中尿囊素濃度的衍生化結合LC-MS方法有效
| 申請號： | 201911026413.6 | 申請日： | 2019-10-26 |
| 公開（公告）號： | CN110579559B | 公開（公告）日： | 2022-03-08 |
| 發明（設計）人： | 吳凌云;於江華;王曉霞;彭帥 | 申請（專利權）人： | 無錫濟煜山禾藥業股份有限公司 |
| 主分類號： | G01N30/89 | 分類號： | G01N30/89;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/72 |
| 代理公司： | 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130 | 代理人： | 王為;孟旭 |
| 地址： | 214028 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 測定 細胞 基質 尿囊素 濃度 衍生 結合 lc ms 方法 | ||
1.一種測定細胞基質中尿囊素濃度的衍生化結合LC-MS方法，所述方法，步驟如下：
步驟1，待測樣品檢測溶液的制備：
取10μL轉運樣品液，加入90μL空白細胞基質，20μL 0.3mol/L NaOH于85℃水浴鍋中反應60min,再加入40μL 0.25mmol/L DNPH于85℃水浴鍋中反應20min得反應產物GLX-DNPH；
步驟2，標準品溶液的制備：
取100μL尿囊素液，加入20μL0.3mol/L NaOH于85℃水浴鍋中反應60min,再加入40μL2.5mmol/L DNPH于85℃水浴鍋中反應20min得反應產物GLX-DNPH；取反應產物16μL，于冰盒上加入84μL空白細胞基質，再加入20μL0.6mol/L NaOH、40μL 2mol/L HCl；
步驟3，內標溶液的制備：
稱取10.31mg 5-硝基吲哚-2-甲酸于50ml量瓶中，用甲醇定容至刻度線，即得1000μmol/L的母液，用超純水稀釋至1.5μmol/L備用；
步驟4，檢測：
分別向160μL待測樣品檢測溶液和標準品溶液中加入40μL 1.5μmol/L的內標溶液和200μL乙腈沉淀蛋白，過濾，得待測樣品的細胞轉運實驗樣品溶液，和標準曲線制備樣品溶液，將標準曲線制備樣品溶液配制成濃度為0.08，0.16，0.31，0.63，1.25，2.5，3.75，5μmol/L的樣品，樣品各自混勻后，12000rpm，4℃，離心10min,取上清液130μL進樣于LC-MS，得到色譜圖，根據標準曲線制備樣品色譜圖繪制標準曲線，根據待測樣品色譜圖和標準曲線，計算待測樣品尿囊素濃度；
其中：色譜條件如下：
色譜柱VP-ODS column，2.0mm i.d.×150mm,4.6μm,Shimadzu,Kyoto,Japan，5mM甲酸銨為A相，90％乙腈為B相，流動相的流速為0.3ml/min，進樣量為5μL，梯度洗脫程序為0.01-4.50min:22％B，4.50-10.00:22％B-35％B，10.00-12.00min:35％-90％B，12.00-15.00:90％B，15.00-17.00min:90％-22％B，17.00-22.00min:22％B；質譜采集時間為22min；接口電壓為-3.5kv；霧化氣流速為1.5L/min；干燥氣流速為15L/min。
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