[發明專利]一種測定細胞基質中尿囊素濃度的衍生化結合LC-MS方法

有效

• 申請號: 201911026413.6
• 申請日: 2019-10-26
• 公開（公告）號: CN110579559B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發明（設計）人: 吳凌云;於江華;王曉霞;彭帥
• 申請（專利權）人: 無錫濟煜山禾藥業股份有限公司
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/72
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為;孟旭

本發明提供一種測定細胞基質中尿囊素濃度的衍生化結合LC?MS方法，該方法利用尿囊素堿水解和酸水解后生成的乙醛酸與2,4?二硝基苯肼發生縮合反應，形成穩定衍生物乙醛酸?2,4?二硝基苯腙，該衍生物具有較高的質譜電噴霧離子化效率，利用5?硝基吲哚?2?甲酸作為內標物，能夠對細胞樣品中的尿囊素進行定量化的分析。

技術領域

本發明屬于分析化學方法領域,具體涉及一種利用衍生化結合LC-MS技術測定細胞中尿囊素濃度的方法。

技術背景

尿囊素鋁，別名二羥基尿囊素鋁；尿羥鋁；胃腸寧；為制酸及胃黏膜保護藥，上市劑型片劑：100mg，含尿囊素55mg、氫氧化化鋁45mg。尿囊素鋁的藥理作用：能加速損傷部位正常肉芽組織的生長及促進黏膜上皮細胞的再生。尿囊素鋁的適應證：消化道黏膜保護藥。用于胃潰瘍、十二指腸球部潰瘍、慢性胃炎。尿囊素鋁中，尿囊素的結構式如下：尿囊素是尿素的衍生物，農業和輕化工領域。尿囊素廣泛存在于自然界，如胎兒的尿以及除人和類人猿以外的其他所有哺乳動物的尿囊液中都含有尿囊素。在一些植物體中，如煙草籽、麥種、甜菜、藥用倒提壺草、紫藤花及紫草科中的雛菊根中也含有尿囊素。

現有尿囊素的檢測方法還有有液相色譜串聯三重四級桿質譜法，這種方法往往會使用13C1,15N1-尿囊素作為同位素內標，其中有的為增加尿囊素在色譜柱上的保留會使用正相色譜柱，這種方法對儀器和內標的都有較高的要求，成本較高。另一種方法則是衍生化結合HPLC法，可在360nm處進行定量檢測，但是這種方法的靈敏度較低，無法檢測微量的內源性物質。如《中南藥學》2008年02期公開了一種衍生化法測定糖尿樂膠囊中尿囊素的含量.《中國新藥雜志》2004年第5期435-438,柱前衍生高效液相色譜法測定人血漿中尿囊素濃度,公開了建立血漿中尿囊素的濃度測定方法，尿囊素與2,4-二硝基苯肼(DNPH)反應生成2,4-二硝基苯腙,內標為加替沙星，結果:在此色譜條件下,尿囊素衍生物與血漿中其他成分的分離完全，可用于人體血漿中尿囊素濃度的測定。

本發明提供一種衍生化結合LC-MS方法，該方法能夠精確測定細胞樣品中由外源性尿囊素水解產生的乙醛酸和細胞基質中的內源性乙醛酸，從而計算出尿囊素的真實含量。乙醛酸是一種基本有機化工原料，廣泛應用于醫藥和日用化學品領域。內源性乙醛酸是植物體中光呼吸的中間產物，也有文獻報道動物的血漿和尿液中也含有內源性的乙醛酸。乙醛酸的結構式如下：

本發明的方法實現了對細胞基質中的極性小分子尿囊素進行準確的定量分析，避免了由生物樣品中較多內源性極性小分子產生的較強的基質效應以及含鹽樣品使用正相柱分析對色譜柱及儀器產生的損害，突破了液相色譜串聯三重四級桿質譜(LC-MS/MS)結合¹³C₁,¹⁵N₁-尿囊素作為同位素內標的方法對儀器和內標具有較高要求的限制，彌補了衍生化結合HPLC法靈敏度較差，無法準確定量微量尿囊素的不足。

發明內容

本發明的目的是，采用衍生化結合液質聯用(HPLC-MS、LC-MS)技術，又叫液相色譜-質譜聯用技術測定細胞中的尿囊素濃度,以避免直接測定極性小分子時易受到基質中其他內源性極性小分子物質干擾而造成基質效應過強的問題。

為了實現本發明的上述目的,本發明提供了如下技術方案：

一種測定細胞基質中尿囊素濃度的衍生化結合LC-MS方法，精確測定細胞中內/外源性乙醛酸濃度,該方法利用尿囊素水解生成乙醛酸，乙醛酸與2,4-二硝基苯肼發生反應，生成穩定的衍生產物乙醛酸-2,4-二硝基苯腙。衍生物具有較高的質譜電噴霧離子化效率，同時利用與衍生產物結構和分子量相似的內標物5-硝基吲哚-2-甲酸，結合液質聯用技術，對細胞中的尿囊素進行定量化的分析。

為此，本發明提供一種測定細胞基質中尿囊素濃度的衍生化結合LC-MS方法，所述方法，步驟如下：

步驟1，待測樣品檢測溶液的制備：