[發(fā)明專利]一種高效利用淀粉生產(chǎn)L-亮氨酸的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911024821.8
• 申請(qǐng)日: 2019-10-25
• 公開（公告）號(hào): CN110643648A
• 公開（公告）日: 2020-01-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐建中;史可;王穎妤;章潔穎;郝宇晨;張偉國
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P13/06
• 分類號(hào): C12P13/06;C12N15/01;C12N1/36;C12N15/77;C12N1/21;C12R1/15
• 代理公司: 32257 蘇州市中南偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 蘇張林

本發(fā)明公開了一種高效利用淀粉生產(chǎn)L?亮氨酸的方法，屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過對(duì)棒桿菌屬的L?亮氨酸產(chǎn)生菌進(jìn)行溫度誘導(dǎo)的適應(yīng)性進(jìn)化處理，提高菌株對(duì)高溫的耐受性。隨后，在此突變菌株基礎(chǔ)上異源表達(dá)來源于芽孢桿菌屬微生物(如B.amyloliquefaciens)中α?淀粉酶編碼基因，在棒桿菌屬的L?亮氨酸產(chǎn)生菌中構(gòu)建了可高效利用淀粉的代謝途徑，從而改善了最適菌體生長溫度與α?淀粉酶最適作用溫度不一致的的缺點(diǎn)，獲得了高效利用淀粉生產(chǎn)L?亮氨酸的重組谷氨酸棒桿菌。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高效利用淀粉生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

L-亮氨酸是人和動(dòng)物所需的八種必需氨基酸之一，因與L-纈氨酸和L-異亮氨酸同具有甲基側(cè)鏈分支結(jié)構(gòu)而統(tǒng)稱為支鏈氨基酸。L-亮氨酸具有多種生理功能，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，飼料工業(yè)和制藥等工業(yè)。同時(shí)，L-亮氨酸在氨基酸靜脈輸液等方面的用量日益增長，是應(yīng)用于臨床氨基酸復(fù)合輸液中不可缺少的原料之一，對(duì)維持病危病人的營養(yǎng)需求，搶救患者生命起著積極的作用。谷氨酸棒狀桿菌是目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的主要工業(yè)菌株。然而，由于L-亮氨酸的合成途徑長、反饋調(diào)控機(jī)制嚴(yán)格，所以其生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率仍然較低，現(xiàn)階段其產(chǎn)量已經(jīng)無法滿足日益增長的市場需求。因此，迫切需要研發(fā)構(gòu)建以廉價(jià)底物為原料高效合成L-亮氨酸高產(chǎn)菌株。

目前，國內(nèi)外選育L-亮氨酸高產(chǎn)菌株的方法主要包括傳統(tǒng)的物理-化學(xué)誘變、代謝工程調(diào)控、細(xì)胞重組技術(shù)以及基因工程技術(shù)等。選育L-亮氨酸高產(chǎn)菌株的主要思路有：①解除三種支鏈氨基酸對(duì)生物合成途徑上的乙酰羥酸合成酶(AHAS)、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶(AHAIR)、二羥酸脫水酶(DHAD)等3個(gè)共用酶的協(xié)同反饋?zhàn)瓒糇饔茫虎诮獬齃-纈氨酸對(duì)AHAS的反饋抑制作用；③解除L-亮氨酸對(duì)α-異丙基蘋果酸合成酶(IPMS)的反饋抑制和阻遏作用，如選育L-亮氨酸和L-纈氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性標(biāo)記的突變株；④改變菌體的正常代謝，使像氨基酸這類的代謝產(chǎn)物大量的積累，如選育某些藥物類(如磺胺胍)或抗生素類(如利福平)抗性標(biāo)記的突變株。雖然上述方法取得利率一定的成果，但是目前用于發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的碳源全都采用葡萄糖。由于目前用于工業(yè)化生產(chǎn)L-亮氨酸的菌株其產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率仍然較低，所以生長成本一直居高不下。如何采用廉價(jià)底物為唯一或主要原料生產(chǎn)L-亮氨酸，成為國內(nèi)外氨基酸生產(chǎn)企業(yè)和氨基酸產(chǎn)生菌育種專家亟待需要解決的問題。

眾所周知，棒桿菌屬的微生物只能利用少數(shù)幾種糖類如葡萄糖、蔗糖、果糖和麥芽糖作為碳源用于菌體生長和合成某些代謝產(chǎn)物，其中葡萄糖是棒桿菌屬的微生物偏好利用的碳源。對(duì)于大多數(shù)棒桿菌屬的微生物來說，它們無法利用淀粉、纖維素等多糖，其原因是它們細(xì)胞內(nèi)不存在分解利用這些多糖的酶。目前，雖有報(bào)道通過在谷氨酸棒桿菌中異源表達(dá)來自鏈霉菌屬或鏈球菌屬微生物中的α-淀粉酶可以實(shí)現(xiàn)以淀粉為唯一碳源合成氨基酸(如L-賴氨酸)，但產(chǎn)量無法與以葡萄糖為主要碳源相比，無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供一種高效利用淀粉生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，通過對(duì)棒桿菌屬的L-亮氨酸產(chǎn)生菌進(jìn)行溫度誘導(dǎo)的適應(yīng)性進(jìn)化處理，提高菌株對(duì)高溫的耐受性。隨后，在此突變菌株基礎(chǔ)上異源表達(dá)來源于芽孢桿菌屬微生物中α-淀粉酶編碼基因，在棒桿菌屬的L-亮氨酸產(chǎn)生菌中構(gòu)建了可高效利用淀粉的代謝途徑，從而改善了最適菌體生長溫度與α-淀粉酶最適作用溫度不一致的的缺點(diǎn)，獲得了高效利用淀粉生產(chǎn)L-亮氨酸的重組谷氨酸棒桿菌。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種高效利用淀粉生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，包括如下步驟：

(1)將出發(fā)棒桿菌接種于LBG液體培養(yǎng)基中，在最適溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，測定出發(fā)棒桿菌在最適生長溫度下的比生長速率χ₀，即μ＝χ₀；