[發明專利]一種高效利用淀粉生產L-亮氨酸的方法在審

申請號：	201911024821.8	申請日：	2019-10-25
公開（公告）號：	CN110643648A	公開（公告）日：	2020-01-03
發明（設計）人：	徐建中;史可;王穎妤;章潔穎;郝宇晨;張偉國	申請（專利權）人：	江南大學
主分類號：	C12P13/06	分類號：	C12P13/06;C12N15/01;C12N1/36;C12N15/77;C12N1/21;C12R1/15
代理公司：	32257 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙)	代理人：	蘇張林
地址：	214122 江***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	亮氨酸高效利用棒桿菌屬淀粉生產產生菌淀粉酶耐受性芽孢桿菌屬微生物重組谷氨酸棒桿菌淀粉酶編碼基因生物催化技術代謝途徑菌體生長突變菌株溫度誘導異源表達不一致構建菌株淀粉進化
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【權利要求書】：

1.一種高效利用淀粉生產L-亮氨酸的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將出發棒桿菌接種于LBG液體培養基中，在最適溫度下進行培養，測定出發棒桿菌在最適生長溫度下的比生長速率χ₀，即μ＝χ₀；

(2)將步驟(1)中生長至對數生長中后期的出發棒桿菌接種至新鮮LBG液體培養基中，并在34-36℃進行培養，測定菌株在34-36℃下的比生長速率μ＝χ₁；進一步將上述生長至對數生長中后期的菌株接種至新鮮LBG液體培養基中，并在34-36℃進行培養，測定菌株在34-36℃下的比生長速率μ＝χ₂；重復上述步驟，直至菌株在34-36℃下比生長速率μ≈χ₀，得到在34-36℃下正常生長的突變菌株；

(3)采用步驟(2)相同方法，以步驟(2)得到的在34-36℃下正常生長的突變菌株為出發菌株，誘導在39-41℃下正常生長的突變菌株；

(4)采用步驟(2)相同方法，以步驟(3)得到的在39-41℃下正常生長的突變菌株為出發菌株，誘導在44-46℃下正常生長的突變菌株；

(5)以步驟(4)得到的在44-46℃下正常生長的突變菌株為宿主菌，異源表達α-淀粉酶基因，得到能夠表達α-淀粉酶的重組菌；

(6)以淀粉作為唯一碳源，利用步驟(5)得到的重組菌發酵生產L-亮氨酸。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的棒桿菌為谷氨酸棒桿菌。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述的培養是在28-32℃，100-150r/min轉速下培養。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述的培養是在100-150r/min轉速下培養。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(5)中，所述的α-淀粉酶基因來源于解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(6)中，所述的發酵的具體步驟為：將重組菌單菌落接種至LBG培養基中培養至對數期，將種子培養液轉接至改良發酵培養基進行發酵生產L-亮氨酸。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的改良發酵培養基為：可溶性淀粉40-50g/L，(NH₄)₂SO₄ 10-20g/L，CH₃COONH₄ 10-20g/L，KH₂PO₄ 2-4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-1.5g/L，MnSO₄·4H₂O 0.05-0.15g/L，檸檬酸鈉2-4g/L，尿素2-5g/L，L-蛋氨酸0.5-1.5g/L，L-谷氨酸0.5-1.5g/L，L-異亮氨酸0.05-0.15g/L，鹽酸鹽甜菜堿1-2g/L，生物素0.0003-0.0008g/L，硫胺素0.0005-0.0010g/L，CaCO₃ 30-50g/L。