[發明專利]一種真菌毒素ZEN降解酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201911024030.5
• 申請日: 2019-10-25
• 公開（公告）號: CN110684754B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 沐萬孟;張文立;徐煒;張振霞
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;A23K20/189;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種真菌毒素ZEN降解酶突變體及其應用，屬于生物工程技術領域。本發明公開了來源于Gliocladium roseum MA918的玉米赤霉烯酮降解酶(簡稱ZENG酶)作為親本，利用基因突變技術，第134位的組氨酸His和136位的絲氨酸Ser同時替換成苯丙氨酸Phe，得到雙突變體H134F/S136F。最適催化條件下，酶在53℃保溫2min后殘余酶活提高了36％；保溫5min后的殘余酶活提高了33％；保溫7min后殘余酶活提高了12％。在58℃保溫2min后殘余酶活提高了34％，保溫5min后的殘余酶活提高了13％。

技術領域

本發明涉及一種真菌毒素ZEN降解酶突變體及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)又稱F-2毒素，是一種由禾谷鐮刀真菌、黃色鐮刀真菌以及克地鐮刀真菌等多種鐮刀霉菌產生并釋放到土壤環境中的真菌類毒素。ZEN的化學結構由Urry在1966年用核磁共振、經典化學和質譜等技術確定，并被命名為：6-(10-羥基-6氧基-十一碳烯基)β-雷鎖酸內酯。ZEN在世界各地的谷物及其副產品中污染廣泛，給種植業和養殖業帶來巨大損失，也對食品安全構成嚴重威脅。

目前，ZEN的降解方法可分為三類，即物理法、化學法和生物法。

物理法主要包括人工剔除、水洗、脫殼、高溫、壓煮、吸附劑吸附等。對于輕度ZEN污染的谷物可以采用剔除、水洗等手段部分清除ZEN；由于ZEN的熱穩定性較好，在120℃條件下加熱4h也不分解，所以熱處理和壓煮等方式主要對產生ZEN的真菌起殺滅作用，對ZEN的破壞作用較小，而且高溫破壞了食品和飼料的營養價值，影響食品的口感；吸附法主要是利用疏水作用來達到清除食物中真菌毒素的目的，常用的吸附劑包括酵母細胞壁、活性炭、蒙脫石特別是改性蒙脫石、高嶺土和消膽胺等，但吸附劑在吸附毒素的同時，也會結合飼料中如氨基酸和維生素等一些重要的營養物質，影響糧食中的營養物質，降低產品品質，而且毒素也不能被完全降解，因此會對環境造成嚴重影響。

化學法的降解原理是氧化降解，ZEN的化學結構在O₃，H₂O₂等作用下發生改變，最后變成無毒的ZEN副產物。但化學法工作量較大，并且操作時間較長，氧化降解ZEN的同時也會對飼料中的營養成分產生破壞作用，因此仍需改進。

生物法的原理是利用微生物菌體吸附和微生物自身或其產生的酶類降解ZEN，使其成為無毒的產物。特別是后者，具有降解ZEN能力的關鍵酶基因正是目前生物方法研究的重點。目前玉米赤霉烯酮的生物降解技術研究仍然有很多不完善的地方，例如關于酶類降解轉化ZEN的原理研究不夠深入，同時ZEN降解菌功能易衰退以及不穩定等問題層出不窮，有待改進。

因此，提供一種行之有效的生物降解ZEN的方法，具有廣闊的應用前景。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種熱穩定性提高的真菌毒素ZEN降解酶突變體，其氨基酸序列是：

(a)如SEQ ID NO.4所示；

(b)或者，在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有ZEN降解酶活性的由(a)衍生的蛋白質。

本發明的目的之一是提供編碼上述真菌毒素ZEN降解酶突變體的基因。

進一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發明的目的之一是提供含上述基因的質粒，所述質粒包括但不限于pET系列質粒。

進一步地，所述質粒包括pET-22b(+)。

本發明的目的之一是提供表達上述真菌毒素ZEN降解酶突變體的大腸桿菌。

進一步地，所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。