[發明專利]一種測定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法

在審

• 申請號: 201911018573.6
• 申請日: 2019-10-24
• 公開（公告）號: CN111172237A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 孟伊娜;傅力;張平;吳斌;鄭素慧;吳忠紅;張健
• 申請（專利權）人: 新疆農業科學院農產品貯藏加工研究所;韓山師范學院
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 高松

本發明提供一種測定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法，包括以下步驟：(1)蔗糖標準曲線的制作；(2)酶液的制備；(3)蔗糖合成酶或蔗糖磷酸合成酶活性的測定。本發明的方法能夠準確的測定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量。

技術領域

本發明涉及一種測定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法。

背景技術

蔗糖是甜高粱莖稈糖分的主要存在形式，蔗糖在莖稈中的積累關系到甜高粱莖稈中的糖分含量和產量，而莖稈糖分積累過程與蔗糖代謝酶密不可分。植物蔗糖代謝包括蔗糖合成、運輸和轉化。蔗糖代謝由多種酶調控，與蔗糖代謝和積累密切相關的酶主要有蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合成酶(SS)和轉化酶(INV)。蔗糖合成的限速酶是果糖1，6- 二磷酸酯酶(FBPase)和磷酸蔗糖合成酶(SPS)。蔗糖降解由代謝關鍵酶轉化酶、蔗糖合成酶等參與調節。

蔗糖合成酶(Sucrose Synthase，E.C.2.4.1.13)是一種可溶性酶，分子量范圍為280-540，由分子量約為83KD-100KD的亞基構成的四聚體。蔗糖合成最適pH值為8.0～9.5，蔗糖裂解最適pH值為5.5～6.5。蔗糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase，E.C.2.4.1.14) 廣泛存在于植物光和組織和非光和組織中，是一種可溶性酶，由分子量117KD-138KD的亞基構成，為二聚體或四聚體，是一種低豐度蛋白(不到可溶性蛋白的0.1％)，且不穩定。以不同發育時期的甜高粱和采后不同貯藏方式甜高粱莖稈為實驗材料，旨在了解高粱莖稈的SS和SPS的含量變化，為甜高粱品質研究提供理論依據。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種測定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法。

本發明采用的技術方案為：

本發明提供一種測定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法，包括以下步驟：

(1)蔗糖標準曲線的制作；

(2)酶液的制備；

(3)蔗糖合成酶或蔗糖磷酸合成酶活性的測定：

向試管中加入0.05M果糖溶液或F₆P溶液0.1mL，UDPG 0.1mL，0.1M Tris溶液0.1mL，0.05mL 10mM MgCl₂溶液，向空白試管中加入0.1mL 10％NaOH溶液，向所有待測樣品試管中加入酶液0.2mL；將上述試管全部放入37℃水浴中保溫30min；接著取出在沸水浴中加熱1min，流水冷卻；隨后向樣品試管中加0.1mL 10％NaOH溶液，沸水浴加熱10min，流水冷卻；接著將上述試管全部加入3.5mL 36％HCL，85℃水浴加熱10min，流水冷卻；然后將上述試管全部加入0.5mL 0.1％間苯二酚溶液，65℃水浴加熱10min，流水冷卻；接著加入4.5mL蒸餾水，搖勻；最后在480nm下比色；結果按照以下公式計算：單位為：mg·g^-1·h^-1

其中：X：標準曲線上查得蔗糖含量(100μg/mL)

V1：樣品總體積(mL)

V2：測定時取酶液體積(mL)

m：樣品質量(g)

t：酶反應時間(h)。

作為優選，步驟(1)中，所述蔗糖標準曲線的制作方法為：準備一系列不同濃度的蔗糖溶液，然后加入NaOH溶液，沸水浴加熱，并冷卻；接著加入HCL溶液，80℃水浴加熱，并冷卻；隨后加入間苯二酚溶液，65℃水浴加熱，并冷卻；最后在480nm下比色，以蔗糖含量為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制蔗糖標準曲線。