[發(fā)明專利]一種針對塔里木兔的個體識別方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911018252.6
• 申請日: 2019-10-24
• 公開（公告）號: CN110684852B
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃婭琳;陳云霞;邱云亮;徐燕紅;郭海濤;蔣敬;周用武;費(fèi)宜玲
• 申請（專利權(quán)）人: 南京森林警察學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888
• 代理公司: 江蘇海越律師事務(wù)所 32402
• 代理人: 唐小紅

1.一種針對塔里木兔的個體識別方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(一)利用STR片段檢測及多樣性分析篩選出的12個可用于塔里木兔個體識別的STR位點(diǎn)及擴(kuò)增這12個STR位點(diǎn)的引物序列如表1所示；

表1擴(kuò)增塔里木兔STR位點(diǎn)所用引物序列

表2塔里木兔12個STR位點(diǎn)等位基因頻率分布表

(二)檢測樣本DNA的提取：針對塔里木兔的不同狀態(tài)的樣本采用不同的取樣方法；

(三)STR擴(kuò)增：分別將需要進(jìn)行個體識別的樣本DNA作為模板DNA，選取表1中的各STR位點(diǎn)引物分別擴(kuò)增各STR位點(diǎn)，得到STR擴(kuò)增產(chǎn)物：

其中，PCR擴(kuò)增體系配方為下述兩種配方中的任意一種：

配方一：

配方二：

PCR擴(kuò)增條件為：首先在98℃保溫2min，然后進(jìn)行30個保溫循環(huán)，所述保溫循環(huán)為在98℃保溫10s、在60℃保溫10s、在72℃保溫10s，最后在72℃保溫5min，保溫結(jié)束后將樣品置于4℃保存；

(四)擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測；

(五)同一認(rèn)定的統(tǒng)計學(xué)計算：當(dāng)兩份樣本在所檢測的12個基因座的STR分型圖譜完全一致時，需計算其個體識別的證據(jù)強(qiáng)度，即似然率；

(六)個體識別的認(rèn)定：似然率大于或等于1×10¹²時可認(rèn)定兩份樣本的同一性；若兩份樣本在所檢測的12個基因座存在不一致的STR分型圖譜，可排除兩份樣本的同一性；

所述個體識別的證據(jù)強(qiáng)度的計算方法為：

LR＝1/P(X)，

其中P(X)代表表型組合X的組合概率；

P(X)＝P1×P2×P3×…×Pi，

Pi為第i個基因座的表型頻率，其中基因座的表型頻率是根據(jù)上述表2中的12個STR位點(diǎn)等位基因頻率進(jìn)行確定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的塔里木兔的個體識別方法，其特征在于，步驟(二)中，肌肉組織剪取10mg～30mg置于EP管中，骨骼磨取20mg～30mg骨粉置EP管中，皮毛剪取皮部分或毛發(fā)的毛囊部分10mg～30mg置于EP管中、血痕剪取適量置EP管中；樣本的基因組總DNA均用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取，其中，骨骼、毛發(fā)組織消化時間延長為20～30h；用分光光度法檢測樣本DNA的純度和濃度；將提取到的樣本總DNA置于-20℃～-70℃保存，待后續(xù)試驗(yàn)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的塔里木兔的個體識別方法，其特征在于，步驟(四)具體包括：

(1)將甲酰胺與毛細(xì)管電泳內(nèi)標(biāo)GS500liz按體積比130:1混合，配成mix；

(2)用國產(chǎn)96孔反應(yīng)板分裝mix，每個孔中加入10μl mix；

(3)對應(yīng)著在96孔板中加入0.5μl STR擴(kuò)增產(chǎn)物，離心到4000rpm即停；

(4)用金屬浴加熱器將混合板95℃加熱預(yù)變性5min，拿出后立即放入-20℃環(huán)境中；

(5)冷卻后拿出，4000rpm離心，解凍、混勻；

(6)上測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析；

(7)結(jié)果圖譜用GeneMapper軟件進(jìn)行分析，得到塔里木兔STR分型圖譜。