[發明專利]一條可與2-溴-1-茚醇結合的核酸適配體及其篩選方法

在審

• 申請號: 201911015354.2
• 申請日: 2019-10-24
• 公開（公告）號: CN111676224A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發明（設計）人: 李灝;胡鴻煒;高若楠;安文林;丁于敬
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

本發明涉及一條可與2?溴?1?茚醇結合的核酸適配體及其篩選方法。該方法包括非固定靶物的SELEX篩選、克隆測序、親和力測定。通過此方法篩選的得到了能與2?溴?1?茚醇結合，且親和力較高的適配體。通過鏈霉親和素與生物素作用將輔助序列固定于磁珠上，再通過堿基互補配對將DNA文庫與輔助序列結合，加入靶物，DNA文庫中能與靶物結合的序列由于構象變化從輔助序列上脫離，從而篩選出能與靶物結合的適配體。本發明篩選出2?溴?1?茚醇適配體，可用于檢測化工廠、制藥廠等工業廢水中2?溴?1?茚醇的濃度。

技術領域

本發明屬于工業污水檢測領域，特別涉及到利用分子生物學技術中的SELEX技術(指數富集的配基系統進化技術)篩選一條能與2-溴-1-茚醇結合的核酸適配體及其篩選方法。為該核酸適配體在化工廢水、制藥廢水中2-溴-1-茚醇的監管和分析檢測等方面的應用提供科學依據和理論基礎。

背景技術

鹵代污染物，也稱為鹵化有機污染物，主要包括氟化有機化合物，氯化有機化合物和溴化有機化合物。鹵代有機化合物廣泛應用于工業和農業生產中的原料和溶劑，有機合成，中間體和藥物合成等領域。除化學合成外，自然界中也存在諸多種類的鹵代有機化合物，比如海洋環境、生物合成、自然界活動等都可以產生鹵代有機化合物。隨著人造化學劑的使用越來越廣泛，許多有機鹵化污染物不可避免地排放到水和大氣中，對生態安全和人類健康構成威脅。

2-溴-1-茚醇是一種含有溴原子的有機鹵代污染物，存在于化工廠、制藥廠等工業廢水中。通過氣相色譜-質譜聯用或者適配體的方法可以檢測廢水中2-溴-1-茚醇含量。氣相色譜-質譜聯用方法雖然可以檢測出樣品中所有化合物種類及相對含量，但是費用較高，操作復雜，不能定量分析。

核酸適配體是一小段經體外篩選得到的能夠與相應靶物，如DNA、RNA、有機小分子、蛋白質等進行高親和力和強特異性結合的單鏈核苷酸序列。然而，適用于小分子的適配體可用性仍然不足。這主要是由于在SELEX過程中需要在固體底物上固定靶標，對于小藥物可能具有挑戰性，同時可能會降低適配體特異性。為了規避這一限制，Nutiu和Li發了一種適用于小分子的無固定靶標SELEX實驗方案，后來更名為capture-SELEX。簡單來說，寡核苷酸文庫兩個隨機區域之間設計有15個核苷酸的對接序列。文庫的對接區域通過與互補生物素化結合的寡核苷酸序列雜交將ssDNA固定到磁珠上。當靶物與能夠識別靶物的ssDNA結合時，靶物誘導的構象轉換使得和磁珠結合的ssDNA洗脫，得到能夠與靶物結合的寡核苷酸序列。核酸適配體可以應用于醫藥界、生物學界的高效快速識別,具有廣闊的應用前景。適配體與抗體相比，適體顯示出很大的優勢：適配體的篩選不需要經過制備抗體過程中的動物實驗部分，可以得到沒有免疫原性或者免疫原性較低的分子的適配體序列；適配體與靶物結合具有高親和力和強特異性，能夠結合的底物范圍更加廣泛；在不同的篩選條件下得到的和特定靶物結合的適配體差別較小，純度較高；適配體的大小和抗體相比較小，篩選過程操作方便，重現性好，經過化學合成和修飾后可以增加穩定性；適配體的化學性質比起生物制劑酶或抗體更加穩定，可以在常溫下進行運輸，能夠儲存的時間也更長。適配體用于檢測水中2-溴-1-茚醇的含量，這種方法更為快速便捷，準確度高。

發明內容

本發明的目的在于克服現有檢測技術的不足，提供一種具有比蛋白抗體更高親和特異性、無免疫原性、能夠化學合成的、分子量小且性質穩定的可用于檢測2-溴-1-茚醇的核酸適配體。本發明采用SELEX技術，以2-溴-1-茚醇為靶物，以2-茚酮為反篩靶物，篩選出與2-溴-1-茚醇特異性結合的核酸適配體。

上述目的通過以下技術方案實現：

1.合成以下所示的ssDNA文庫和引物：

ssDNA文庫：

5’-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-N39-CCT ATG CGT GCT ACC GTG AA-3’

上游引物：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’