[發明專利]一條可與2-溴-1-茚醇結合的核酸適配體及其篩選方法

在審

• 申請號: 201911015354.2
• 申請日: 2019-10-24
• 公開（公告）號: CN111676224A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發明（設計）人: 李灝;胡鴻煒;高若楠;安文林;丁于敬
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

1.可與2-溴-1-茚醇結合的核酸適配體，其特征在于，序列如下：

AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAGCTAGCAGCACAGAGGTCAGATG--GATGCAGGTTGACCCTCGCTTTGTCGTTGGCGACGTGCCC—CCTATGCGTGCTACCGTGAAAGCCAGCAGCACAGAGGTCAGATGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAGCTAGCAGCACAGAGGTCAGATGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAGCTAGCAGCACAGAGGTCAGATGCCTATGCGTGCTACCGTGAA。

2.制備如權利要求1所述的可與2-溴-1-茚醇結合的核酸適配體的方法，其特征在于：

1)合成以下所示的ssDNA文庫和引物：

ssDNA文庫：

5’-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-N39-CCT ATG CGT GCT ACC GTG AA-3’

上游引物：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’

下游引物：5’-Bio-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’

2)SELEX技術篩選特異性核酸適配體

實驗過程所需溶液

(1)結合洗脫液Binding and Washing Buffer：10mM Tris-HCl,1mM EDTA,2M NaCl，pH7.5

(2)篩選液Selection Buffer：100mMNaCl,20mM Tris-HCl,2mM MgCl₂,5mM KCl,1mMCaCl₂,pH 7.6

(3)清洗液Washing Buffer：40mM Tris-HCl,10mM EDTA,3.5M尿素，0.02％Tween 20,pH＝8.0

2.2磁珠預操作

(1)使用前將PuriMag鏈霉親和素磁珠在磁力分離機上振蕩20秒，混合均勻；

(2)用移液槍吸取500μL磁珠加入1.5mL離心管中，用磁鐵沉降磁珠；

(3)去除上清液，用500μL Binding and Washing(BW)Buffer洗滌三次后重懸磁珠，分裝；

(4)在Selection Buffer中制備1mM的2-溴-1-茚醇儲備溶液，分裝，儲存在4℃備用；

2.3磁珠的結合與篩選

(1)取50μL重懸的磁珠，加入生物素化結合寡核苷酸10μL，在室溫下溫和攪拌1小時，使磁珠和生物素化的下引結合；將固定化混合物放于磁鐵上靜置，去除上清液；

(2)用100μL Selection Buffer洗滌磁珠三次，然后用100μL Selection Buffer重懸；

(3)在離心管中加入10μL ssDNA原始文庫，在95℃條件下處理5分鐘使文庫序列伸展，再于冰浴上放置10分鐘使原始文庫與生物素化結合寡核苷酸結合；在室溫下振蕩培養45分鐘，用100μL Selection Buffer洗滌磁珠3次；

(4)取30μL已制備好的2-溴-1-茚醇溶液和處理過的磁珠混合，室溫下振蕩45分鐘，用磁鐵將磁珠與上清液分離，收集上清液，以上清液為模板進行PCR；

2.4PCR擴增

(1)以上清液為模板，下游引物和上游引物進行PCR擴增；

(2)取65μL的鏈霉親和素磁珠，用Washing Buffer洗滌三次，每次200μL,加入PCR產物中，室溫振蕩45分鐘，用磁鐵分離磁珠，去除上清液；用Washing Buffer洗滌磁珠三次，每次200μL；

(3)向磁珠中加入50μL超純水，95℃處理十分鐘制備核酸單鏈，得次級ssDNA文庫，保存在-20℃冰箱中。

3.制備如權利要求1所述的可與2-溴-1-茚醇結合的核酸適配體的方法，其特征在于，還能有如下步驟：

2.5檢測

(1)得到的次級文庫分為三份，一份保存，一份用于Q-PCR檢測，一份用于下一輪篩選；

(2)以次級文庫為模板，下游引物和上游引物進行Q-PCR檢測，分析熔解曲線以判斷擴增的特異性；

(3)Q-PCR測得到的Ct值應逐輪降低；當Q-PCR測得到的Ct值不變時，結束篩選；

2.6反篩

選擇和靶物結構相似的物質做為反篩物，從第三輪開始每隔兩次篩選進行一次反篩，先反篩再正篩；

2.7驗證

每輪篩選得到的次級文庫經過PCR擴增后，用2％體積分數的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，與marker比較所得條帶大小是否約為80bp；

3.克隆、測序及序列分析

將最后一輪篩選產物通過PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，對80bp條帶進行切膠回收，然后送往公司進行測序；

測序結果用DNAMAN軟件進行分析，符合上下游引物結構組成和長度的序列送至公司合成，然后進行Kd值檢測，用UNAfold分析序列的二級結構；測序結果排除形成引物二聚體以及含有上游引物下游引物互補鏈的序列后，有一個序列符合文庫模板；

序列如下：

AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAGCTAGCAGCACAGAGGTCAGATG--GATGCAGGTTGACCCTCGCTTTGTCGTTGGCGACGTGCCC—CCTATGCGTGCTACCGTGAAAGCCAGCAGCACAGAGGTCAGATGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAGCTAGCAGCACAGAGGTCAGATGCCTATGCGTGCTACCGTGAAAGCTAGCAGCACAGAGGTCAGATGCCTATGCGTGCTACCGTGAA。