[發明專利]可定向誘導的、抗凋亡的多能干細胞及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 201911005295.0
• 申請日: 2019-10-22
• 公開（公告）號: CN110819593A
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發明（設計）人: 陳敏;王霞;周繼曾;陳晃耀;魏愈慧;藍婷;鄒慶劍;周小青;唐成程;張焜;周仁平;賴良學
• 申請（專利權）人: 五邑大學;江門市大健康國際創新研究院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;A61K35/545;A61P25/02;A61P21/00
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 孫浩

本發明公開了一種可定向誘導的、抗凋亡的多能干細胞及其制備方法與應用，利用基因修飾技術，將Tet?On系統和抗凋亡基因Bcl轉入hiPSC中，建立可定向誘導為運動神經元的hiPSC。所得多能干細胞既保留了hiPSC本身來源廣、增殖快的優點，又保證了干細胞分化方向的可控性及移植后細胞在體內的存活數量，解決了干細胞移植安全性和有效性問題。同時，本發明方案能夠為ALS及其它神經退行性疾病的治療奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及干細胞技術領域，特別涉及一種可定向誘導的、抗凋亡的多能干細胞及其制備方法與應用。

背景技術

退行性疾病通常伴隨特定神經元的病變或損傷，其中肌萎縮側索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)患者主要是由于運動神經元的廣泛死亡。由于神經元的不可再生性，目前的治療方法均無法逆轉神經損傷。干細胞可以分化為相應神經細胞以替代受損神經元，修復神經環路，因此能夠應用于神經退行性疾病的修復治療。早在2001年，Mazzini等人首次在臨床試驗中，證實了間充質干細胞在ALS病人身上具有較高的安全性和耐受性^[1]。隨后，越來越多的臨床研究指出，移植間充質干細胞可以降低運動神經元的退化速度，調控細胞因子的分泌，抑制神經炎癥反應，進而改善ALS患者的臨床癥狀，提高患者的生存質量^[2,3]。盡管間充質干細胞移植在臨床試驗中安全性高、耐受性好，但其治療效果偏弱，可能原因是間充質干細胞并不能嵌入病人的脊髓中，整合和分化為運動神經元，很難實現干細胞替代損傷神經元的目的。

因此，一些科學家直接將已分化完成的運動神經元移植到動物體內中進行研究。其中，Wichterle等人將胚胎干細胞(embryonic stem,ES)分化的運動神經元注射到雞胚(15-17d)的脊髓中，發現分化的運動神經元可以大量存活，并延長軸突至肌肉處，形成神經肌肉接頭^[4]。此外，Harper等人把ES分化的運動神經元注射到截癱的大鼠腰椎中，發現分化的運動神經元可延伸軸突長度，形成神經肌肉接頭，并重新支配麻痹的肌肉組織^[5]。但是，該方法只適用于截癱這樣的靜態模型，對于不斷惡化、預后極差的ALS并沒有效果^[6]。并且，神經元分化過程復雜、成本高、耗時長(1個月以上)、效率低(20％-50％)，且不能增殖，嚴重的限制了其臨床應用^[7]。

誘導性多能干細胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)是近年來干細胞領域中具有里程碑意義的突破。尤其是通過異位表達幾個與維持ES多潛能性相關的關鍵性核轉錄因子(如c-MYC、KLF4、OCT3/4、SOX2等)使體細胞發生重編程，為獲得與患者自身遺傳背景一致的多能干細胞增加了一個新途徑。該方法操作簡單且避免了使用ES的倫理問題，是組織工程、再生醫學、疾病模型和藥物篩選的理想種子細胞，因此，具有廣闊的臨床應用前景。

iPSC增殖快、來源廣、分化潛能高，且相對于ES無倫理學爭議，但以iPSC 為基礎的治療仍然面臨兩大難題：一方面iPSC具有成瘤傾向，安全性受到極大的挑戰；另一方面移植細胞在體內不易存活，且分化方向不可控制，導致其有效性也得不到保障。且目前關于運動神經元的定向分化大多數限于體外研究，而關于基因修飾后的iPSC能否在體內定向高效分化為運動神經元，及其對ALS發揮治療作用，尚未可知。

參考文獻：

[1]Mazzini L,Fagioli F,Boccaletti R,Mareschi K,Oliveri G,Oliveri C,Pastore I,Marasso R,Madon E.Stem cell therapy in amyotrophic lateralsclerosis:a methodological approach in humans[J].Amyotrophic LateralSclerosis and Other Motor Neuron Disorders,2003,4(3):158-161.