[發(fā)明專利]一種煙草煙堿合成調(diào)控基因NtERF91的克隆和應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201911005278.7
• 申請日: 2019-10-22
• 公開（公告）號: CN110684779A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 隋學(xué)藝;王丙武;宋中邦;高玉龍;李文正;李梅云;趙璐;袁誠;張洪博;師君麗;李永平;孔光輝;曾建敏;鄒聰明;劉勇;黃昌軍;吳興富
• 申請（專利權(quán)）人: 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 53115 昆明今威專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 歐陽橋

本發(fā)明公開了煙草煙堿合成調(diào)控基因NtERF91及其克隆方法與應(yīng)用，煙堿合成調(diào)控基因NtERF91核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本發(fā)明還公開了煙堿合成調(diào)控基因NtERF91的克隆方法，具體步驟包括：A、確定NtERF91基因序列；B、提取煙草RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA；C、根據(jù)NtERF91基因序列設(shè)計合成特異性引物，以cDNA作為模板，進行PCR擴增；D、回收和純化PCR產(chǎn)物；E、構(gòu)建了含NtERF91基因的過表達載體。將過表達載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在煙草中過表達，制備轉(zhuǎn)基因植株。獲得的轉(zhuǎn)基因植株煙堿含量比對照提高了60％以上。說明煙草NtERF91基因在培育高煙堿含量的煙草方面具有較大的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草煙堿合成調(diào)控基因NtERF91的克隆方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

煙草(Nicotiana tabacum)是重要的經(jīng)濟作物，是茄科一年生草本植物。煙堿是栽培煙草重要的特征化合物，占煙草總生物堿的95％左右。

ERF(Ethylene Response Factor)類型的轉(zhuǎn)錄因子基因是普通煙草中調(diào)控?zé)焿A合成重要調(diào)控因子。煙草中調(diào)控?zé)焿A合成的NIC2遺傳位點已被發(fā)現(xiàn)是由至少7個ERF基因組成，如NtERF189，NtERF179等。今年來，隨著基因組和測序技術(shù)的發(fā)展，ERF類轉(zhuǎn)錄因子對煙堿合成調(diào)控的分子機理也逐漸清晰。根據(jù)相關(guān)報道，煙草ERF轉(zhuǎn)錄因子家族中IX亞族中的ERF(NIC2位點)轉(zhuǎn)錄因子可以通過直接結(jié)合煙堿合成途徑中關(guān)鍵代謝限速酶基因(如NtPMT、NtQPT)的啟動子中的GCC-box來轉(zhuǎn)錄激活該基因的表達，進而增強煙堿的合成與積累。

國際上一些知名煙草公司和相關(guān)煙草研究機構(gòu)正在開展利用生物技術(shù)手段提高煙草煙堿含量進行研究，用來積極應(yīng)對新型煙草制品原料的需求，從而提高煙草品質(zhì)，也為降低電子煙等產(chǎn)品的煙堿原料生產(chǎn)成本。目前，我國也亟需深入研究合成調(diào)控機理，為培育高煙堿低焦油煙草品種提供理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的在于提供一種煙草煙堿合成調(diào)控基因NtERF91；第二目的在于提供所述的煙草煙堿合成調(diào)控基因NtERF91的克隆方法；第三目的在于提供所述的煙草煙堿合成調(diào)控基因NtERF91的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一目的是這樣實現(xiàn)的，所述的煙草煙堿合成調(diào)控基因NtERF91的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明的第二目的是這樣實現(xiàn)的，包括以下步驟：

A、確定NtERF91基因序列；

通過分析茉莉素處理煙草根部組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得受茉莉素正向調(diào)控ERF家族基因1個，序列比對發(fā)現(xiàn)該基因為NtERF91。根據(jù)該基因序列設(shè)計基因克隆引物：

正向引物NtERF91-BamH I：GGATCCATGTTAACTAGTGTCAATACCACGT；

反向引物NtERF91-Xho I：CTCGAGTCAATTTTCAGCCAATTTTCTCTTC；

B、提取煙草根組織RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA；

C、以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA作為模板，利用NtERF91基因克隆引物進行PCR擴增，回收和純化PCR產(chǎn)物；

D、純化產(chǎn)物與載體連接，連接體系與過程如下：4μL純化產(chǎn)物、1μL saltsolution、1μL -BluntⅡ-TOPO(Invitrogen)混勻，25℃，水浴30min；將連接好的載體通過熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，加液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)，挑取菌落進行菌液培養(yǎng)，質(zhì)粒提取和PCR檢測。篩選陽性克隆，對陽性克隆進行測序。