[發明專利]一種煙草煙堿合成調控基因NtERF91的克隆和應用

在審

• 申請號: 201911005278.7
• 申請日: 2019-10-22
• 公開（公告）號: CN110684779A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 隋學藝;王丙武;宋中邦;高玉龍;李文正;李梅云;趙璐;袁誠;張洪博;師君麗;李永平;孔光輝;曾建敏;鄒聰明;劉勇;黃昌軍;吳興富
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 53115 昆明今威專利商標代理有限公司
• 代理人: 歐陽橋

1.一種煙草煙堿合成調控基因NtERF91，其特征在于所述的煙草煙堿合成調控基因NtERF91的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.根據權利要求1所述的煙草煙堿合成調控基因NtERF91，其特征在于所述的煙草煙堿合成調控基因NtERF91編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一種權利要求1所述的煙草煙堿合成調控基因NtERF91的克隆方法，其特征在于包括以下步驟：

A、確定NtERF91基因序列；

根據茉莉酸處理煙草根部組織轉錄組分析獲得NtERF91基因序列；利用此序列設計基因克隆引物：

正向引物NtERF91-BamH I：GGATCCATGTTAACTAGTGTCAATACCACGT；

反向引物NtERF91-XhoI：CTCGAGTCAATTTTCAGCCAATTTTCTCTTC；

B、提取煙草根組織RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA；

C、根據NtERF91基因序列設計合成特異性引物，以反轉錄得到的第一鏈cDNA作為模板，進行PCR擴增，回收和純化PCR產物；

D、純化產物與載體連接，通過試劑盒反應與TOPO載體連接，連接體系與過程如下：4μL純化產物、1μL salt solution、1μL -Blunt Ⅱ-TOPO混勻，25℃，水浴30min；將連好的載體通過熱激轉化進入大腸桿菌DH5α，加液體培養基振蕩培養后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上過夜培養，挑取菌落進行菌液培養，質粒提取和PCR檢測；篩選陽性克隆，對陽性克隆進行測序。

4.根據權利要求3所述的煙草煙堿合成調控基因NtERF91的克隆方法，其特征在于C步驟中PCR擴增的反應體系是選用Phusion高保真擴增酶反應體系，體系總體積50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反應緩沖液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的 High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，補水至50μL。

5.根據權利要求3所述的煙草煙堿合成調控基因NtERF91的克隆方法，其特征在于C步驟中PCR擴增的反應條件是在 pro擴增儀上進行，反應程序為：98℃，30秒；98℃，7秒，58℃，30秒，72℃，30秒，35個循環；72℃延伸7分鐘。

6.一種權利要求1或2所述的調控煙草葉片煙堿含量的基因NtERF91的過表達載體，其特征在于所述的調控煙草葉片煙堿含量的基因NtERF91的過表達載體為pK2GW7-NtERF91。

7.一種權利要求1所述的煙草煙堿合成調控基因NtERF91的應用，其特征在于所述的煙草煙堿合成調控基因NtERF91在用于獲得煙堿含量顯著提高的轉基因植株中的應用。