[發(fā)明專利]紅耳龜檢測(cè)方法及用于檢測(cè)紅耳龜?shù)腜CR引物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911003998.X
• 申請(qǐng)日: 2019-10-22
• 公開（公告）號(hào): CN110564868B
• 公開（公告）日: 2022-11-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董姍姍;章嫡妮;劉燕;張振華;盧曉強(qiáng);于賜剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 重慶百潤(rùn)洪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50219
• 代理人: 郝艷平

1.一種紅耳龜檢測(cè)方法，其特征在于，包括：

獲取多種不同龜類對(duì)應(yīng)的多組脫氧核糖核酸DNA；

采用正向引物KM216748F和反向引物KM216748R，分別對(duì)多組所述DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)絇CR擴(kuò)增反應(yīng)，得到對(duì)應(yīng)的多組PCR產(chǎn)物；所述正向引物KM216748F的引物序列為：5′-TCTCAATTTTCTTCTAGGGT-3′；所述反向引物KM216748R的引物序列為：5′-GTTAGATGTTGTGGGTTA-3′；

采用瓊脂糖凝膠分別對(duì)多組所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，對(duì)于每組所述PCR產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的電泳檢測(cè)結(jié)果：

判斷所述PCR產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的電泳檢測(cè)結(jié)果中是否出現(xiàn)148堿基對(duì)bp大小的特征條帶；

若所述PCR產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的電泳檢測(cè)結(jié)果中出現(xiàn)148bp大小的特征條帶，則確定所述PCR產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的DNA為紅耳龜?shù)腄NA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠的濃度為1.5％。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述獲取多種不同龜類對(duì)應(yīng)的多組DNA，包括：

獲取多種不同龜類對(duì)應(yīng)的多組樣本組織；

采用丹尼斯血液和組織試劑盒DNeasy BloodTissue Kit提取每組所述樣本組織的DNA，得到多組所述DNA。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用正向引物KM216748F和反向引物KM216748R，分別對(duì)多組所述DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，包括：

對(duì)于每組所述DNA：

采用10微升μl的2×預(yù)混物Mastermix、7μl的雙蒸水ddH₂O、1ul濃度為5微摩μM的1μl正向引物KM216748F和1μl濃度為5μM的反向引物KM216748R，在預(yù)設(shè)條件下對(duì)1μl的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述預(yù)設(shè)條件包括：

95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)每組所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)的電泳條件包括：

電泳電壓為135V、電泳時(shí)長(zhǎng)為30min。

7.一種用于檢測(cè)紅耳龜?shù)腜CR引物，其特征在于，包括：

正向引物KM216748F，所述正向引物KM216748F的引物序列為：5′-TCTCAATTTTCTTCTAGGGT-3′；

反向引物KM216748R，所述反向引物KM216748R的引物序列為：5′-GTTAGATGTTGTGGGTTA-3′。