[發明專利]一種檢測四種腸道病毒的試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201911002544.0
• 申請日: 2019-10-21
• 公開（公告）號: CN110863065A
• 公開（公告）日: 2020-03-06
• 發明（設計）人: 古柏燕;彭忠
• 申請（專利權）人: 珞可為科技（武漢）有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發明公開了一種檢測四種腸道病毒的試劑盒及其檢測方法。涉及柯薩奇病毒A10型、柯薩奇病毒A9型、柯薩奇病毒B2型和B5型。本發明應用一步法實時熒光定量RT?PCR技術，采用CVA10、CVA9、CVB2、CVB5病毒高度特異的引物和熒光標記探針，通過一個PCR反應即可判定待測樣本中是否存在這4種型別的柯薩奇病毒，比單重熒光定量PCR方法更便捷迅速、節約成本。本發明對檢測的病毒進行實時準確定量，根據病毒感染的滴度，為臨床早期診斷提供工具，為臨床治療方案的制定提供參考依據。可應用于腸道病毒引起暴發疫情的實驗室應急診斷、腸道病毒快速篩查分型、臨床診斷及手足口病的流行病學的研究。

技術領域

本發明屬于病毒檢測試劑盒技術領域，涉及實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，特別是涉及一種同時檢測四型柯薩奇病毒株的試劑盒及其檢測方法。

背景技術

柯薩奇病毒(Coxsackievirus)是一種腸道病毒(enterovirus)分為A和B兩類，是一類常見的經呼吸道和消化道感染人體的病毒，感染后人會出現發熱、打噴嚏、咳嗽等感冒癥狀，同時也是導致手足口病的主要病原。手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由人類腸道病毒感染引起的，以手、足、口、臀部出現皮疹癥狀為主要臨床癥狀的常見傳染病，主要以輕癥為主，但重癥及死亡病例也時有報道。根據中國疾病預防控制中心全國法定報告傳染病發病、死亡統計的最新數據顯示(http://www.chinacdc.cn/tjsj/fdcrbbg/)，自2008年至2016年7月，中國大陸共有15,432,764例手足口病例，其中3,486例死亡。手足口疾病在我國的感染形勢依然嚴峻。

以往的大多報道中，導致手足口病的病原體主要為為腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(Coxsackie virus A16，CVA16)。而近年來在世界范圍內，除EV71和CVA16之外其他腸道病毒引起的手足口病病例及疫情事件越來越多。2008年新加坡CVA6與CVA10感染引起35.3％的手足口病病例；。2012年，云南省爆發的手足口疫情中，CV-B2與重癥手足口病有關；2010-2012年，石家莊地區手足口疫情有CV-B3的流行。埃克病毒6型(Echoviruses 6，E-6)、E-9、E-30及CV-A5等腸道病毒型別也有相關報道。由此可見，引起手足口病的人類腸道病毒型別多，且病原譜容易發生時間和空間的變遷。

目前我國的腸道病毒分子診斷市場，仍然以檢測腸道病毒通用型或腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型為主，導致手足口病病原體檢測不明確或漏檢等，造成患者治療的延誤及診斷試劑的浪費等。現在主要研究的柯薩奇病毒，柯薩奇病毒A組9型(coxsackievirusA9，CVA9)和柯薩奇病毒A組10型(coxsackievirus A10，CVA10)，柯薩奇病毒B組2型(coxsackievirus B2，CVB2)和柯薩奇病毒B組5型(coxsackievirus B5，CVB5)也越來越受到廣泛的關注。

為了較好地指導對上述四種病毒的研究，需要開發一種能夠檢測柯薩奇病毒A9型、柯薩奇病毒A10型、B柯薩奇病毒2型和柯薩奇病毒B5型的產品。然而，傳統的檢測方法或檢測產品單次只能檢測一種病毒類型，當一次性檢測多種病毒類型時，多條引物之間存在相互干擾，導致引物二聚體、假陽性等問題，不利于對上述四種病毒的研究。

發明內容

為了解決現有技術中無法同時檢測多種型別柯薩奇病毒的問題，本發明提供了基于熒光定量PCR技術的4種型別柯薩奇病毒核酸的檢測引物和探針，涉及柯薩奇病毒A10型、柯薩奇病毒A9型、柯薩奇病毒B2型和B5型，以實現快速、有效且準確檢測柯薩奇病毒型別。

本發明另一個目的是提供一種檢測四型柯薩奇病毒的四重熒光定量試劑盒，是一種一步法四重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒。

本發明再一個目的是提供上述試劑盒在制備檢測4種型別柯薩奇病毒的試劑中的應用。

本發明第四個目的是提供上述試劑盒的使用方法。