[發明專利]尿苷二磷酸葡萄糖高產菌株及其應用

有效

• 申請號: 201910986721.7
• 申請日: 2019-10-16
• 公開（公告）號: CN110699373B
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發明（設計）人: 吳旭日;許韶華;李萌;陳依軍
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P19/60;C12P19/56;C12R1/19
• 代理公司: 南京艾普利德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32297
• 代理人: 張鉑

UDPG依賴糖基轉移酶(UGTs)可催化多種化合物葡萄糖基化修飾，但價格昂貴且穩定性不佳的糖供體UDPG(尿苷二磷酸葡萄糖)成為限制UGTs的規模化應用的主要因素。鑒于現有解決措施的局限性，本發明采用“開源節流”的策略改造了大腸桿菌中嘧啶合成途徑、改變了碳源流量和UDPG的代謝去路，構建了UDPG高產菌株，并驗證了其應用的可行性。同時，實現了天然非營養型甜味劑萊鮑迪苷KA的高效生物合成。

技術領域

本發明屬于天然產物生物合成和微生物代謝工程以及食品化工技術領域，具體涉及一種提高大腸桿菌內源性UDPG含量的方法，以及使用該方法獲得的UDPG高產菌株及其應用。

背景技術

糖基化修飾是改善或改變天然產物物理性質與生物活性的重要手段之一。與化學方法相比，酶法糖基化修飾具有反應條件溫和、選擇性好及綠色環保等優點，被受學術界和工業界關注。UDP-葡萄糖依賴的糖基轉移酶(UDP-glycosyltransferases，UGTs，EC2.4.1.x)是以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)為糖基供體的一類酶，廣泛存在于植物、動物及微生物體內，數量巨大(Bock?KW.Biochem?Pharmacol,2016,99:11-17)。UGTs可區域選擇性和立體選擇性地催化天然和非天然化合物的定點糖基化修飾，可作為一種有效的工具酶應用于精細化工、藥物開發、食品飲料、日用化工品及農藥等眾多領域(Lairson?LL,et?al.AnnuRev?Biochem,2007,77:521-555；Bak?S,et?al.Plant?Physiol,2008,148:1295-1308；ChenHY,et?al.Plant?J?2017,89:195-203)。

大量消耗價格昂貴且穩定性不佳的UDP-葡萄糖(UDPG)是UGTs產業化應用的主要限制因素，致使UGTs目前僅局限于實驗室規模的應用。為了解決UGTs糖基供體UDPG的來源問題，降低UGTs催化化合物糖基化修飾的成本，研究人員在大腸桿菌宿主中開展了一系列的嘗試。1)構建體外再生體系，減少外源性UDPG的用量。體外一鍋法(One-pot)反應體系是最為常用的UDPG再生策略，即將UGTs催化的糖基化修飾反應與蔗糖合酶催化的UDPG合成反應兼容性偶聯，實現UDPG的循環供應。Sayaka等將擬南芥的蔗糖合酶AtSUS-1與糖基轉移酶CaUGT2偶聯一鍋法實現了姜黃素的糖基化，糖基化修飾效率提高了7倍，外源性UDPG降低了90％(K,et?al.Biotechnol?Adv,2016,34:88-111)。但是，該UDPG再生反應體系仍需要外加少量的UDPG，且穩定性較差。2)UDP-葡萄糖代謝途徑改造，增加內源性UDPG合成量。利用代謝工程改造宿主的UDPG生物合成途徑，提高內源性含量，并采用全細胞反應與發酵法進行底物的糖基化修飾是近年來廣泛使用的糖基化修飾策略之一。在常用宿主大腸桿菌中，UDPG合成相關酶的過表達如UDPG焦磷酸化酶(galU)和磷酸葡萄糖變位酶(pgm)是內源性UDPG合成量提高的常用策略，但效果不夠明顯。因此，韓國鮮文大學的Sohng課題組自2013年開始在大腸桿菌BL21(DE3)的中先后過表達了galU，敲除了6-磷酸葡萄糖異構酶(pgi)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(zwf)和UDP-葡萄糖水解酶(ushA)基因，構建了工程菌株E.coli?MA3F。通過在E.coli?MA3F中過表達相關UGT，實現了芹菜素和黃芩素的糖基化修飾，但底物濃度較低，且轉化不完全(Thuan?NH?et?al.Process?Biochem,2013,48:1744–1748)。3)引入外源UDPG合成途徑，提高內源性UDPG含量。費文理等在大腸桿菌中引入蔗糖磷酸化酶(BasP)和兩歧雙歧桿菌的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(ugpA)基因，并偶聯糖基轉移酶EUGT11構建了全細胞催化劑實現了萊鮑迪苷D高效合成，但底物濃度有待提高(費理文等.食品與發酵工業,2018,44:1-7)。