[發(fā)明專利]尿苷二磷酸葡萄糖高產(chǎn)菌株及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910986721.7
• 申請日: 2019-10-16
• 公開（公告）號: CN110699373B
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳旭日;許韶華;李萌;陳依軍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P19/60;C12P19/56;C12R1/19
• 代理公司: 南京艾普利德知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32297
• 代理人: 張鉑

1.尿苷二磷酸葡萄糖高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，其特征在于對合成尿苷二磷酸葡萄糖菌株進(jìn)行改造，通過游離質(zhì)粒的方式單個(gè)過表達(dá)嘧啶合成途徑中的相關(guān)關(guān)鍵酶乳清酸焦磷酸化酶?pyrE、乳清酸核苷酸脫羧酶?pyrF或尿嘧啶核苷酸激酶?pyrH，pyrE?的基因序列如?SEQID?NO:1所示，pyrF?基因序列如?SEQ?ID?NO:3?所示，pyrH?基因序列如?SEQ?ID?NO:5?所示，具體包括：

（1）采用pETDuet-1共表達(dá)載體，借助酶切位點(diǎn)構(gòu)建獲得?Arabidopsis?thaliana蔗糖合酶基因與糖基轉(zhuǎn)移酶?OleD?基因的共表達(dá)質(zhì)粒pEaT-GT，蔗糖合酶基因插入?Nco?I/HindIII?位點(diǎn)，OleD?基因插入Nde?I/Xho?I?位點(diǎn)，Arabidopsis?thaliana蔗糖合酶基因序列如SEQ?ID?NO:9?所示，OleD?基因序列如?SEQ?ID?NO:13?所示；

（2）利用共表達(dá)載體?pCDFDeut-1，借助酶切位點(diǎn)?Nco?I/Hind?III構(gòu)建pyrE的單酶表達(dá)質(zhì)粒?pC-E；借助酶切位點(diǎn)Nde?I/Xho?I?構(gòu)建pyrF的單酶表達(dá)質(zhì)粒pC-F；利用酶切位點(diǎn)Nde?I/Xho?I構(gòu)建pyrH?表達(dá)質(zhì)粒?pA-H；將?pC-E、pC-F?或?pA-H?分別轉(zhuǎn)化至E.?coli?BL21獲得工程菌株。

2.根據(jù)權(quán)利要求?1?所述的方法，其特征在于還進(jìn)一步包括抑制6-磷酸葡萄糖異構(gòu)化途徑以及內(nèi)源性尿苷二磷酸葡萄糖代謝途徑。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述抑制6-磷酸葡萄糖異構(gòu)化途徑是指敲除6-?磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因?pgi，避免?6-磷酸葡萄糖異構(gòu)化為6-磷酸果糖，促使6-磷酸葡萄糖?進(jìn)入尿苷二磷酸葡萄糖合成途徑。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述抑制內(nèi)源性尿苷二磷酸葡萄糖代謝途徑是指敲除尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因，避免內(nèi)源性尿苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為?UDP-葡萄糖酸。

5.尿苷二磷酸葡萄糖高產(chǎn)菌株，其特征在于采用權(quán)利要求?1-4任一項(xiàng)所述方法構(gòu)建獲得的菌株。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述尿苷二磷酸葡萄糖高產(chǎn)菌株的應(yīng)用，其特征在于在尿苷二磷酸葡萄糖高產(chǎn)菌株中共表達(dá)蔗糖合酶和尿苷二磷酸葡萄糖依賴的糖基轉(zhuǎn)移酶，構(gòu)建生物催化劑用于化合物的高效葡萄糖基化修飾。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述尿苷二磷酸葡萄糖高產(chǎn)菌株為大腸桿菌。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述尿苷二磷酸葡萄糖高產(chǎn)菌株作為生物催化劑合成萊鮑迪苷KA、羅漢果苷或糖基化黃豆苷元。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述尿苷二磷酸葡萄糖高產(chǎn)菌株作為生物催化劑合成萊鮑迪苷KA?反應(yīng)條件為：底物甜茶苷濃度為2.5～25?g/L；蔗糖濃度為500～900?g/L；反應(yīng)溫度為25℃～55℃；反應(yīng)?pH?為5.5～10；菌體濃度為25?g/L～125?g/L。