[發明專利]一種冷凍電鏡樣品制備方法

有效

• 申請號: 201910984577.3
• 申請日: 2019-10-16
• 公開（公告）號: CN110823931B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 章新政;吳春玲;石會剛
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: G01N23/20008
• 分類號: G01N23/20008;G01N1/42;G01N23/20;G01N23/04
• 代理公司: 北京中強智尚知識產權代理有限公司 11448
• 代理人: 黃耀威

本發明提供了一種冷凍電鏡樣品制備方法，步驟如下：預先設置凍樣裝置的濕度、溫度和吸水時間并更換干燥濾紙；向凍樣裝置內加入液氮使后續加入到凍樣裝置內的氣態乙烷或/和丙烷液化為?160℃ˉ?40℃液態乙烷或/和丙烷；用鑷子夾取預處理的冷凍載網，將鑷子固定在凍樣裝置的凍樣桿上，在冷凍載網上添加含水樣品使含水樣品在冷凍載網上形成超薄液膜；通過提高所述液態乙烷或/和丙烷與形成液膜的冷凍載網的相對運動速率來提高冷卻速率對冷凍載網上的液膜進行冷凍，使液膜中的水在?160℃ˉ?40℃條件時在冷凍載網上形成高溫玻璃態水，將樣品包埋在玻璃態水中。本發明提供的冷凍電鏡樣品制備方法，能夠更容易獲得更高質量冷凍樣品。

技術領域

本發明涉及透射電鏡樣品制備技術領域，特別涉及一種冷凍電鏡樣品制備方法。

背景技術

冷凍電鏡技術是利用透射電子顯微鏡對包埋在低溫玻璃態冰中樣品進行成像和結構解析的技術。20世紀80年代，Jacques·Dubochet博士發現利用液態乙烷可將快速插入的超薄生物樣品(小于1微米)包埋在玻璃態冰中。該樣品制備技術將生物樣品包埋在低溫玻璃態冰中，使得生物樣品在近生理環境中成像同時能夠減輕輻照損傷對生物樣品的影響。低溫雖然能減輕電子對生物樣品的輻照損傷，但并不能完全抑制輻照損傷。在冷凍電鏡單顆粒三維重構技術的數據收集過程中，生物樣品受高能電子的照射，在前時會經歷一個被稱為rapid“burst”的電子束引起的樣品漂移階段，在這個階段樣品漂移速度很快以至于無法使用現有的矯正軟件來矯正，進而大大降低了該階段數據的質量而得不到此階段的高分辨結構。但是前的樣品卻又是受電子輻照損傷最小的，包含樣品最多的結構信息。由于此階段電子束引起的劇烈的漂移現象，目前還沒有任何有效的辦法來獲得前的高分辨信息。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠更容易獲得更高質量冷凍樣品的冷凍電鏡樣品制備方法。

為解決上述技術問題，本發明提供了一種冷凍電鏡樣品制備方法，包括如下步驟：

預先設置凍樣裝置的濕度、溫度和吸水時間并更換干燥濾紙；

向凍樣裝置內加入液氮預冷使后續加入到凍樣裝置內的氣態乙烷或/和丙烷液化為-160℃ˉ-40℃液態乙烷或/和丙烷；

用鑷子夾取預處理的冷凍載網，將鑷子固定在凍樣裝置的凍樣桿上，在冷凍載網上添加含水樣品使含水樣品在冷凍載網上形成超薄液膜；

通過提高所述液態乙烷或/和丙烷與形成液膜的冷凍載網的相對運動速率來提高冷卻速率對冷凍載網上的液膜進行冷凍，使液膜中的水在-160℃ˉ-40℃條件時在冷凍載網上形成高溫玻璃態水，將樣品包埋在玻璃態水中；

把包埋樣品的冷凍載網放入液氮中保存待用。

進一步地，所述通過提高液態乙烷或/和丙烷與形成液膜的冷凍載網的相對運動速率來提高冷卻速率對冷凍載網上的液膜進行冷凍，可把形成水膜的冷凍載網迅速插入以1-50m/s的速度流動的所述液態乙烷或/和丙烷中進行冷凍。

進一步地，所述通過提高液態乙烷或/和丙烷與形成液膜的冷凍載網的相對運動速率來提高冷卻速率對冷凍載網上的液膜進行冷凍，可使所述凍樣桿以1-50m/s速度豎直下落、并在所述液態乙烷或/和丙烷中下落0.5-50cm的距離進行冷凍。

進一步地，所述通過提高液態乙烷或/和丙烷與形成液膜的冷凍載網的相對運動速率來提高冷卻速率對冷凍載網上的液膜進行冷凍，可將所述凍樣桿一端固定，連有鑷子的另一端水平釋放，使凍樣桿靠自身重力或/和通過機械彈簧在凍樣桿的固定端、或中間位置、或樣品端豎直施加外力，實現凍樣桿從水平位置開始在豎直平面內帶動冷凍載網沿凍樣桿的固定端做高速的圓周運動，使冷凍載網劃過所述液態乙烷或/和丙烷進行冷凍。

進一步地，所述液態乙烷或/和丙烷的溫度也可為-180℃ˉ-160℃。