[發(fā)明專利]一種熱休克蛋白Hsp20的基因克隆、制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910984102.4
• 申請日: 2019-10-16
• 公開（公告）號: CN110627878B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張國強;戚一曼;黃玉;孟想
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽工程大學(xué)
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 蕪湖思誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34138
• 代理人: 楊濤

本發(fā)明提供了一種熱休克蛋白Hsp20的基因克隆、制備方法及應(yīng)用。通過PCR擴增技術(shù)提取并擴增Hsp20蛋白基因，將目的基因擴增產(chǎn)物用于構(gòu)建重組蛋白表達載體，并轉(zhuǎn)化到宿主菌中，高效表達了酒酒球菌Hsp20蛋白基因。所述的Hsp20蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明還提供了Hsp20蛋白基因在不同脅迫條件下的應(yīng)用，可有效提高宿主微生物在逆境下的生存能力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程克隆蛋白質(zhì)領(lǐng)域，特別涉及一種熱休克蛋白Hsp20的基因克隆、制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

微生物在培養(yǎng)過程及保存中，只有在適宜的外界條件和適當?shù)臓I養(yǎng)物質(zhì)下，微生物才能正常生長。如果外界條件不適宜，會受到底物不足、冷熱、酸堿、滲透壓等因素的影響，這些因素會抑制微生物生長甚至引起死亡，菌株的生長會受到影響，而且還會抑制或減少代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。酸脅迫，高溫脅迫、氧脅迫等是常見的微生物細胞所面臨的脅迫，提高微生物的脅迫抗性，將有利于微生物在逆境環(huán)境下生存，保護細胞的正常生命活動。

酒酒球菌在冷凍干燥環(huán)境中，誘導(dǎo)了熱休克Hsp20蛋白的表達，使得菌體對冷凍干燥有了抗性，并且Hsp20蛋白的表達量更高，差異表達最明顯，酒酒球菌抗冷凍干燥的能力越強。酒酒球菌中的Hsp20蛋白基因，可以增強細胞對損害的耐受程度，維持細胞正常的代謝功能，與生物在逆境下的生存能力關(guān)系密切。因此，可以利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將酒酒球菌中Hsp20蛋白基因轉(zhuǎn)入其他菌株中表達，提高該菌體的抗冷凍干燥能力和對不利環(huán)境的耐受性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題：將酒酒球菌中Hsp20蛋白基因克隆并構(gòu)建表達載體，表達載體轉(zhuǎn)入其他宿主菌菌株中表達Hsp20蛋白，以提高該重組菌株對不同脅迫條件的抗性能力。同時可在宿主菌對Hsp20蛋白表達后純化提取Hsp20蛋白。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供以下的技術(shù)方案：

一種熱休克蛋白Hsp20，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。

上述熱休克蛋白Hsp20的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述。

一種上述熱休克蛋白Hsp20的基因克隆方法，包括如下步驟：

(1)利用基因組DNA提取試劑盒從酒酒球菌中提取出總DNA；

(2)以提取的總DNA為模板，利用設(shè)計的克隆引物和表達引物，通過PCR擴增得到Hsp20蛋白基因片段；

所述PCR反應(yīng)條件：①95℃預(yù)變性3min，②95℃變性15s，③50℃退火30s，④72℃延伸30s，⑤重復(fù)35個循環(huán)，⑥72℃延伸5min⑦降溫至4℃；

上游引物：5’-CCGGAATTCATGGCAAATGAATTAATGGA-3’

下游引物：5’-CCGCTCGAGTTGGATTTCAATATGATGAGT-3’

(3)將克隆產(chǎn)物利用EcoRI，XhoI酶切后插入質(zhì)粒載體中構(gòu)建重組蛋白表達載體。

優(yōu)選地，所述酒酒球菌的菌株為酒酒球菌SD-2a。

一種重組蛋白表達載體，重組質(zhì)粒中包含上述的Hsp20蛋白基因。

優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒為pTriEx-hsp20質(zhì)粒。

一種熱休克蛋白Hsp20的制備方法，包括上述重組蛋白表達載體的轉(zhuǎn)化、重組Hsp20基因的表達及重組Hsp20蛋白的純化，具體步驟如下：