[發明專利]細胞周期檢測方法及其所用試劑與試劑盒

在審

• 申請號: 201910983428.5
• 申請日: 2019-10-16
• 公開（公告）號: CN110760564A
• 公開（公告）日: 2020-02-07
• 發明（設計）人: 李佐青;劉津;陳大為;王勝旺;鄧少華;康愷
• 申請（專利權）人: 菲諾克生物科技(上海)有限公司
• 主分類號: C12Q1/44
• 分類號: C12Q1/44;C12Q1/02
• 代理公司: 44224 廣州華進聯合專利商標代理有限公司
• 代理人: 何錦輝

本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種細胞周期檢測方法及其所用試劑與試劑盒。所述方法包括：使用濃度為0.06％～0.3％(g/ml)的皂素與細胞接觸增強其細胞膜的通透性，以使得DNA結合染料與核糖核酸酶能夠進入細胞內并發揮活性。該方法可以顯著縮短檢測時間，最快約10分鐘左右即可完成檢測，且檢測準確度好，效率高。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種細胞周期檢測方法及其所用試劑與試劑盒。

背景技術

真核細胞分裂通過高度受控的包括稱為G1、S、G2和M的連續階段的細胞周期來進行。細胞周期進展是通過許多細胞周期調節相關的信號通路(特別是周期蛋白相關通路)在規定時間和空間激活或關閉來嚴格控制的，它們在細胞周期期間呈現高度的動態性。例如，在特定的細胞周期階段，一些蛋白質從細胞核轉移到細胞質，或者相反，以及一些蛋白質被迅速降解等。

細胞周期狀態的準確確定是研究影響細胞周期或依賴于細胞周期位置的細胞過程的關鍵要求。這些測定在藥物篩選應用中是特別至關重要的。

目前細胞周期檢測方法通常有以下幾種：

1.同位素標記法測定細胞周期

標記有絲分裂百分率法(percentage labeled mitoses，PLM)是一種常用的測定細胞周期時間的方法。其原理是對測定細胞進行脈沖標記、定時取材、利用放射自顯影技術顯示標記細胞，通過統計標記有絲分裂細胞百分數的辦法來測定細胞周期。

2.基于成像的熒光檢測法

FUCCI(fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator,FUCCI)小球能鑒別細胞處在細胞周期的哪一時期，因此可以用來研究癌癥細胞周期的進程。FUCCI技術建立在鑒定過表達的兩種調節細胞周期的蛋白geminin和Cdt1水平上，其中geminin融合的是綠色熒光基團AmCyan，而Cdt1融合的是紅色熒光基團mCherry。Cdt1和geminin的水平隨著細胞周期的變化而不斷波動：Cdt1蛋白水平在G1階段達到峰值，而geminin蛋白水平在S、G2和M期不斷升高。這一結果體現為表達FUCCI細胞核在G1期為紅色而在S、G2和M期則呈現綠色。

3.流式細胞術PI(Propidium Iodide，碘化丙啶)染色法

由于細胞周期各時相的DNA含量不同，通常正常細胞的G1/G0期具有二倍體細胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與DNA結合，其熒光強度直接反映了細胞內DNA含量。因此，通過流式細胞儀PI染色法對細胞內DNA含量進行檢測時，可以將細胞周期各時相區分為G1/G0期、S期和G2/M期，獲得的流式直方圖對應的各細胞周期可通過特殊軟件計算各時相的細胞百分率。主要方法簡述如下：收集細胞；加入75％乙醇；放置過夜(大于24小時)；洗滌后RNase I(RNA酶I，10mg/ml，無DNA酶活性)消化并PI(1mg/ml)染色；上機檢測。

然而方法1放射性污染嚴重，設備要求極高。

方法2操做復雜且設備要求高，單次實驗成本高。

方法3流式細胞術PI染色法是主流檢測方法。然而整個檢測從細胞準備好后，加入75％乙醇作用，細胞固定同時被打孔，至少需要花費24小時才能上機檢測，對于藥企研發和科研研究來說造成了很大的時間損耗。且方法3中，乙醇固定、PI染色與RNA消化是分三步進行的，耗時耗力。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種細胞周期檢測方法，包括：使用0.06％～0.3％(g/ml)的皂素與細胞接觸增強其細胞膜的通透性，以使得DNA結合染料與核糖核酸酶能夠進入細胞內并發揮活性。