[發(fā)明專利]一種靜息細胞轉(zhuǎn)化植物甾醇制備A環(huán)降解物的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910982701.2
• 申請日: 2019-10-16
• 公開（公告）號: CN110699398B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孟浩;劉喜榮;曾春玲;楊芳;趙小娟
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南新合新生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C12P17/06
• 分類號: C12P17/06;C12N1/20;C07D311/94;C12R1/33
• 代理公司: 長沙和雅知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43238
• 代理人: 林傳貴

本發(fā)明公開了一種靜息細胞轉(zhuǎn)化植物甾醇制備A環(huán)降解物的方法，屬于甾族化合物制備技術(shù)領(lǐng)域。發(fā)明內(nèi)容包括種子培養(yǎng)、靜息細胞轉(zhuǎn)化、分離提取、精制步驟。本發(fā)明以植物甾醇為原料生產(chǎn)A環(huán)降解物，原料易得，降低了生產(chǎn)成本；相對于常規(guī)的轉(zhuǎn)化A環(huán)降解物的方法，本發(fā)明的靜息細胞轉(zhuǎn)化植物甾醇制備A環(huán)降解物的方法，歸一含量高，轉(zhuǎn)化時間短，造成的污染小，在實際生產(chǎn)中，能節(jié)約生產(chǎn)成品，提高經(jīng)濟效益。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于甾族化合物制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靜息細胞轉(zhuǎn)化植物甾醇制備A環(huán)降解物的方法。

背景技術(shù)

近代，有關(guān)使用微生物法轉(zhuǎn)化植物甾醇制備甾體中間體的研究成果被廣泛報道和研究，相關(guān)報道最早可追溯到1937年，Mamoli和Vercellone在他們發(fā)表的兩篇專利Ber.70470和Ber.702079中，公開了通過酵母發(fā)酵將17-酮-類固醇還原成17-β-羥類固醇。此后，peterson和Murray在美國專利N0.2602769中公開一種用根霉屬真菌產(chǎn)生孕酮的11-a-羥化方法。1972年，Kraychy等在美國專利N0.3684657中公開了用MycobacteriumSP.NRRL?B-3683降解17位脂肪鏈制備4-AD，ADD的方法。1973年，Marsheck等在美國專利N0.3759791中公開了用Mycobacterium?SP.NRRL?B-3805，以膽甾烷等17位有8個以上碳原子的甾體原料制備4-AD。

A環(huán)降解物是合成雌酚酮和雌二醇及其衍生物的重要中間體，但轉(zhuǎn)化過程中甾核A環(huán)、B環(huán)開環(huán)，非常容易降解，產(chǎn)品難以積累，從而難以達到產(chǎn)業(yè)化標準。A環(huán)降解物在國內(nèi)目前主要利用微生物在油相中轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)，例如專利號為CN104404099A的專利公開了一種發(fā)酵植物甾醇生產(chǎn)A環(huán)降解物的方法，在發(fā)酵轉(zhuǎn)化中用到大豆油，提取困難，廢油難以處理且環(huán)境影響大。

菌株偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium?fortuitum)NK-XHX-103記載在專利號為CN103756940?A的文獻中，一般只用來將植物甾醇轉(zhuǎn)化為δ-內(nèi)酯，目前普遍的研究是通過控制反應(yīng)條件來提高δ-內(nèi)酯的收率。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的是一種靜息細胞轉(zhuǎn)化植物甾醇制備A環(huán)降解物的方法，可以減少廢油產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化時間，提高A環(huán)降解物的產(chǎn)率和純度。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:

本發(fā)明提供一種靜息細胞轉(zhuǎn)化植物甾醇制備A環(huán)降解物的方法，包括以下步驟：

(1)靜息細胞轉(zhuǎn)化：將偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium?fortuitum)NK-XHX-103菌種經(jīng)過斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后接種至轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，過濾分離后對所述植物甾醇進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，對所述植物甾醇進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，得到發(fā)酵產(chǎn)物；

(2)分離提取：轉(zhuǎn)化完成后進行過濾，濾液酸化后用氯仿提取分層，水層用氯仿萃取2-3次，氯仿減壓濃縮，得到A環(huán)降解物粗品；

(3)精制：所述A環(huán)降解物粗品進行精制提純，得到A環(huán)降解物產(chǎn)品。

優(yōu)選地，步驟(1)中NK-XHX-103菌種種子培養(yǎng)的方法包括以下步驟：

(1)斜面培養(yǎng)：培養(yǎng)基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氫二鈉0.1-10g/L，瓊脂20g/L；pH＝7.5-8.0，121℃滅菌30分鐘；

(2)一級種子培養(yǎng)：培養(yǎng)基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氫二鈉0.1-10g/L，接種后，30℃，200rpm搖床培養(yǎng)48h；