[發明專利]一種靜息細胞轉化植物甾醇制備A環降解物的方法

有效

• 申請號: 201910982701.2
• 申請日: 2019-10-16
• 公開（公告）號: CN110699398B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發明（設計）人: 孟浩;劉喜榮;曾春玲;楊芳;趙小娟
• 申請（專利權）人: 湖南新合新生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12P17/06
• 分類號: C12P17/06;C12N1/20;C07D311/94;C12R1/33
• 代理公司: 長沙和雅知識產權代理事務所(普通合伙) 43238
• 代理人: 林傳貴

1.一種靜息細胞轉化植物甾醇制備A環降解物的方法，包括以下步驟：

(1)靜息細胞轉化：將偶發分枝桿菌(Mycobacterium?fortuitum)NK-XHX-103菌種經過斜面培養和液體種子培養后接種至轉化培養基中，過濾分離后對所述植物甾醇進行發酵轉化，得到發酵產物；

(2)分離提取：轉化完成后進行過濾，水層酸化后，用氯仿萃取2-3次，氯仿減壓濃縮，得到A環降解物粗品；

(3)精制：所述A環降解物粗品進行精制提純，得到A環降解物產品；

所述偶發分枝桿菌(Mycobacterium?fortuitum)NK-XHX-103的保藏編號是CCTCCM2013543；

所述步驟(1)中NK-XHX-103菌種種子培養的方法包括以下步驟：

(1)斜面培養：培養基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氫二鈉0.1-10g/L，瓊脂20g/L；pH＝7.5-8.0，121℃滅菌30分鐘；

(2)一級種子培養：培養基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氫二鈉0.1-10g/L，接種后，于30℃，30℃，200rpm搖床培養48h；

(3)二級種子培養：培養基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氫二鈉0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃滅菌30分鐘；將一級種子液按體積比10％接種至二級種子培養基，接種后，于30℃，200rpm搖床培養48h；

(4)種子罐培養：將二級種子液按體積比10％接種至種子罐中；接種后，于30℃，200rpm，空氣流量0.5VVM，罐壓0.05MPa下培養48h-72h；

所述步驟(1)中種子培養完成后將種子菌液進行過濾，濾餅用pH＝8.0的20mM的磷酸鹽緩沖液淋洗并抽濾干；

步驟(1)所述轉化培養基的配方：植物甾醇10-100g/L，羥丙基環糊精10-400g/L，偶發分枝桿菌20-200g/L，PPE?5g/L，余量為20mM?PBS；pH＝7.5-8.0。

2.根據權利要求1所述的一種靜息細胞轉化植物甾醇制備A環降解物的方法，其特征在于，步驟(2)所述的提取方法具體為：將轉化完的菌液進行抽濾或離心，將濾液調pH至2.0，攪拌30分鐘；加入氯仿萃取，靜置8h以上，分層；下層氯仿層分出減壓濃縮至干；上層水層加入氯仿再重復萃取2次，得到的氯仿層繼續減壓濃縮；將濃縮得到的物質加入甲苯升溫至60℃打漿，降溫至0-4℃過濾，濾餅用少量甲苯淋洗。

3.根據權利要求1所述的一種靜息細胞轉化植物甾醇制備A環降解物的方法，其特征在于，所述步驟(3)精制方法具體為：將提取得到的粗品加入甲醇、活性炭，升溫60℃攪拌脫色2h，過濾，并用少量甲醇洗碳；在60℃減壓濃縮，加少量水帶干殘余的甲醇，加入甲苯，再次減壓濃縮，帶干其中的水分，冷卻至0-4℃，養晶2h，抽濾并淋洗，70℃烘干，得固體產物。