[發明專利]乳酸/酸性環境促進無致瘤性的淋巴母細胞去分化獲得致瘤性的研究方法

有效

• 申請號: 201910981353.7
• 申請日: 2019-10-16
• 公開（公告）號: CN110964696B
• 公開（公告）日: 2023-02-03
• 發明（設計）人: 楊萍;胡亞娥
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N5/0781;C12Q1/6886
• 代理公司: 南通市永通專利事務所(普通合伙) 32100
• 代理人: 葛雷

本發明公開了一種一種乳酸/酸性環境促進無致瘤性的淋巴母細胞去分化獲得致瘤性的研究方法，包括細胞培養、低pH培養基制備、細胞形態學檢測、細胞增殖的測定、集落生成實驗、RT?PCR、數據分析等步驟。本發明方法方便、準確。

技術領域

本發明涉及一種乳酸/酸性環境促進無致瘤性的淋巴母細胞去分化獲得致瘤性的研究方法。

背景技術

自從Otto Warburg在1956年提出著名的“無氧糖酵解理論”，認為無氧糖酵解在腫瘤的發生中起了至關重要的作用，無氧代謝也被認為是腫瘤的標志物之一。即使在氧存在的情況下，腫瘤細胞也主要依賴分解糖原產生能量，導致高濃度的乳酸的產生和堆積。乳酸有很多作用。一方面，無氧糖酵解能夠產生能量，維持腫瘤細胞的生長和其他活動；另一方面，糖酵解產生的乳酸能使腫瘤微環境的pH值降低，創造一個能夠促進腫瘤發生發展和轉移的酸性環境。越來越多的證據顯示，曾經被認為是代謝廢物的乳酸，能夠作為一個調控因子，在腫瘤的發生發展和轉移中起到重要的調節作用。確實，實驗證明，在多種腫瘤類型比如淋巴瘤、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌中，組織和細胞中乳酸的濃度和腫瘤的發生、轉移和腫瘤病人的預后差密切相關。因此，乳酸含量和酸性微環境已經被公認為是腫瘤診斷和抗腫瘤治療的標志物。

全世界的科學家都試圖闡明無氧代謝與腫瘤發生發展之間的關系。乳酸通過促進細胞“干性”相關基因或者轉錄因子如SP1,MAZ, MEIS1等高表達或過表達使細胞重編程。Ubaldo等曾報道，乳酸能夠增加細胞的干性。但是，乳酸促進淋巴瘤的發生的機制還不明確。

二代測序技術和基因表達譜分析表明，淋巴瘤的起始和發展與原癌基因的多位點突變導致與腫瘤發生相關的信號通路的激活密切相關。除此之外，高濃度的乳酸和酸性腫瘤微環境也常見于淋巴瘤病人中，對淋巴瘤病人的病情惡化起了一定的推動作用。但是，乳酸引起淋巴瘤惡化的機制迄今還不明確。我們猜想，乳酸可能是通過促進淋巴瘤發生過程中關鍵的原癌基因的表達來實現的，而這些原癌基因有哪些迄今還沒有報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種方便、準確的乳酸/酸性環境促進無致瘤性的淋巴母細胞去分化獲得致瘤性的研究方法。

本發明的技術解決方案是：

一種乳酸/酸性環境促進無致瘤性的淋巴母細胞去分化獲得致瘤性的研究方法，其特征是：包括下列步驟：

(1)細胞培養

HMY2-CIR細胞株的培液是在DMEM高糖培養基中加入了10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，并且調節成不同的pH 值；培養條件為5％CO₂，37℃；

(2)低pH培養基制備

20mM乳酸溶解于上述DMEM中，用pH計測試溶液的pH值，并且在培養基中加入鹽酸將溶液的pH值調至5.6和6.0；

(3)細胞形態學檢測

HMY2-CIR細胞分別用pH7.4,6.0和5.6的培養基培養八周，每三天換一次培養基，然后利用甩片機將細胞黏附到玻片上，用瑞姬氏染液進行染色；

(4)細胞增殖的測定

細胞增殖是用Alamar Blue assay進行檢測：將相同數量的 HMY2-CIR細胞200μl加入96孔培養板中，并在每個孔中加上不同pH 的培養基，用DMSO作為對照，培養三天后，在每個孔中加入10μl的 Alamar Blue染液。并在37℃，5％CO₂的條件下繼續培養2小時，用SpectraMax M5 multi-detection reader讀取560nm至590nm 的吸光度值；

(5)集落生成實驗